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作者單位：中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，中國科學(xué)院大學(xué)
出版期刊：Nature Reviews Molecular Cell Biology
當(dāng)年IF：IF2019=55.470
Online時(shí)間：2020.9.24
DOI：10.1038/s41580-020-00288-9

摘要：源于原核生物的CRISPR-Cas基因組編輯技術(shù)對(duì)植物分子生物學(xué)的改變超出了人們的預(yù)期。CRISPR-Cas 具有穩(wěn)健性、高目標(biāo)特異性和可編程性等特點(diǎn)，可對(duì)作物進(jìn)行精準(zhǔn)的遺傳操作，從而有機(jī)會(huì)創(chuàng)造出具有益性狀的種質(zhì)，并開發(fā)出新型的、更可持續(xù)的農(nóng)業(yè)系統(tǒng)。此外，基于CRISPR-Cas平臺(tái)的眾多新興生物技術(shù)也擴(kuò)大了基礎(chǔ)研究和植物合成生物學(xué)的工具箱。在本綜述中，我們首先簡要介紹了CRISPR-Cas的基因編輯技術(shù)，重點(diǎn)是最新的精準(zhǔn)基因編輯技術(shù)，如堿基編輯和質(zhì)粒編輯。然后，我們將討論CRISPR-Cas在提高植物產(chǎn)量、質(zhì)量、抗病性和抗除草劑性、育種和加速馴化方面的最重要應(yīng)用。我們還重點(diǎn)介紹了CRISPR-Cas相關(guān)植物生物技術(shù)的最新突破，包括CRISPR-Cas試劑遞送、基因調(diào)控、多重基因編輯和誘變及定向進(jìn)化技術(shù)。最后，我們討論了這一改變游戲規(guī)則的技術(shù)應(yīng)用前景。

引言

全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)正面臨前所未有的挑戰(zhàn)。到 2050 年，世界人口將達(dá)到 96 億，對(duì)主要作物的需求將增加 60%¹。由于綠色革命帶來的增產(chǎn)速度持續(xù)下降，而不利的氣候變化預(yù)計(jì)將進(jìn)一步限制植物生產(chǎn)，因此需要培育出對(duì)不利環(huán)境有更強(qiáng)適應(yīng)能力、能提高產(chǎn)量改善品質(zhì)的栽培品種。然而，用于作物育種的傳統(tǒng)策略費(fèi)力、費(fèi)時(shí)、復(fù)雜，需要更有效、更省時(shí)的育種方法²。

隨著測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，越來越多的植物物種的基因組信息可供使用，基因組編輯系統(tǒng)提供了精準(zhǔn)編輯基因的機(jī)會(huì)，為作物改良創(chuàng)造了新的機(jī)遇?；蚪M編輯的基本策略是使用序列特異性核酸酶在目標(biāo)位點(diǎn)誘導(dǎo) DNA 雙鏈斷裂（DSB）。此后，依賴于供體的同源定向修復(fù)（HDR）途徑或容易出錯(cuò)的非同源末端連接途徑都會(huì)修復(fù) DSB 并引入某種基因變化。早期的序列特異性核酸酶，包括巨核酸酶³、鋅指核酸酶⁴和轉(zhuǎn)錄激活劑樣效應(yīng)核酸酶⁵，已被證明可有效用于植物基因組編輯，但它們的構(gòu)建需要復(fù)雜的蛋白質(zhì)工程，這限制了它們的適用性。

CRISPR（簇狀的、有規(guī)律間隔的、短回文重復(fù)序列）-Cas（CRISPR相關(guān)蛋白）是古生菌和細(xì)菌的一種適應(yīng)性噬菌體免疫系統(tǒng)。由于CRISPR-Cas9和其他 CRISPR-Cas 系統(tǒng)依靠 DNA-RNA 識(shí)別和結(jié)合來進(jìn)行序列特異性核酸切割，因此可以很容易地進(jìn)行編程，以最低的成本在任何所需的靶位點(diǎn)引入DSB⁶。自 2013 年首次應(yīng)用于植物^7-9以來，CRISPR-Cas 已被用于多種作物的基因組編輯，為其中許多物種引入了極具價(jià)值的農(nóng)業(yè)性狀¹⁰。特別是新開發(fā)的精準(zhǔn)CRISPR-Cas技術(shù)，由于能誘導(dǎo)精確的核苷酸變化，有望對(duì)農(nóng)業(yè)產(chǎn)生重大影響。然而，CRISPR-Cas 的功能遠(yuǎn)不止編輯特定基因座來改良作物。以這一改變游戲規(guī)則的多功能平臺(tái)為基礎(chǔ)，一些新型植物生物技術(shù)已經(jīng)出現(xiàn)，它們能夠促進(jìn)基因調(diào)控和蛋白質(zhì)工程。這些技術(shù)已經(jīng)對(duì)基礎(chǔ)生物學(xué)研究產(chǎn)生了影響，并帶來了廣泛應(yīng)用的前景。

在本綜述中，我們首先介紹了基于CRISPR-Cas精準(zhǔn)基因組編輯分子平臺(tái)。然后，我們討論了 CRISPR-Cas 在作物改良、農(nóng)業(yè)育種和野生物種馴化方面的最新應(yīng)用。我們還討論了幾種與CRISPR-Cas相關(guān)的植物生物技術(shù)，包括新型傳遞方法、基因表達(dá)調(diào)控、多重和高通量基因編輯以及原位定向進(jìn)化。我們的目的是全面總結(jié)CRISPR-Cas技術(shù)在植物中的發(fā)展，并展望未來的應(yīng)用前景。

Table 1. 植物中精準(zhǔn)基因編輯技術(shù)的特征

ABE，腺嘌呤堿基編輯器；AFID，APOBEC-Cas9 融合誘導(dǎo)刪除系統(tǒng)；APOBEC3Bctd，APOBEC3B 的羧基末端催化結(jié)構(gòu)域；CBE，胞嘧啶堿基編輯器堿基編輯器；CaMV，花椰菜花葉病毒；dCas9，無催化活性的 Cas9；ecTadA，大腸桿菌 tRNA 特異性腺苷脫氨酶；ecTadA*，大腸桿菌 tRNA 特異性腺苷脫氨酶變體；M-MLV，莫羅尼小鼠白血病病毒；NA，不可用；nCas9，Cas9 切分酶；STEME，飽和定向內(nèi)源突變編輯器；UGI，UGI 編輯器。產(chǎn)品純度根據(jù)所需編輯產(chǎn)品的比例進(jìn)行評(píng)估。

Figure 1. 脫氨酶介導(dǎo)和反轉(zhuǎn)錄酶介導(dǎo)的植物精準(zhǔn)基因組編輯技術(shù)。

(a) 植物堿基編輯技術(shù)。堿基編輯器由 Cas9 nickase（nCas9；帶有D10A突變）與兩種蛋白質(zhì)融合而成：脫氨酶和尿嘧啶DNA糖基化酶抑制劑（UGI）。胞嘧啶堿基編輯器（CBE）可生成胞嘧啶堿基編輯器（CBE）產(chǎn)生 C:G>T:A 堿基置換，而腺嘌呤堿基編輯器（ABE）產(chǎn)生 A:T>G:C 堿基置換。nCas9 與這兩種堿基編輯器的融合被稱為 "飽和定向內(nèi)源突變編輯器"（STEME 編輯器"（STEME），利用單個(gè)引導(dǎo) RNA（sgRNA）同時(shí)產(chǎn)生 C:G>T:A 和 A:T>G:C 雙堿基置換。

(b) APOBEC-Cas9 融合誘導(dǎo)刪除系統(tǒng)（AFID）。胞苷脫氨酶將胞苷轉(zhuǎn)化為尿苷，然后與胞苷脫氨酶-Cas9 復(fù)合物融合的尿嘧啶 DNA 糖基化酶（UDG）切除尿苷并生成一個(gè)嘧啶（AP）位點(diǎn)，該位點(diǎn)被單獨(dú)但共同表達(dá)的 AP 裂解酶切分。堿基切除修復(fù)后，Cas9 誘導(dǎo)的 DNA 雙鏈斷裂位點(diǎn)與脫氨基胞苷之間會(huì)產(chǎn)生精確的缺失。

(c) 質(zhì)粒編輯技術(shù)。質(zhì)粒編輯工具由 nCas9 與反轉(zhuǎn)錄酶和質(zhì)粒編輯引導(dǎo) RNA（pegRNA）融合而成。pegRNA 在反轉(zhuǎn)錄酶模板的 3′端攜帶所需的突變（綠色標(biāo)記）。引物結(jié)合位點(diǎn)（PBS）與nicked DNA鏈結(jié)合，從而將模板反轉(zhuǎn)錄為所需的 DNA 序列。編輯后的核苷酸會(huì)以精確的方式插入目標(biāo)位點(diǎn)。PAM，原間隔鄰接基序。

Figure 2. CRISPR-Cas9在育種技術(shù)中的應(yīng)用

(a) 單倍體誘導(dǎo)。對(duì)MATRILINEAL（MTL）和DMP等基因進(jìn)行CRISPR-Cas9編輯可產(chǎn)生單倍體誘導(dǎo)系，從而縮短穩(wěn)定遺傳背景所需的時(shí)間。

(b) 誘導(dǎo)有絲分裂以固定雜種活力。有絲分裂代替減數(shù)分裂（MiMe）基因型的植物可以通過在卵細(xì)胞中異位表達(dá) BABY BOOM 1 (BBM1) 并引發(fā)孤雌生殖，或通過破壞MTL并導(dǎo)致父本基因組的消除，產(chǎn)生二倍體配子。

(c) 通過CRISPR-Cas在預(yù)定位點(diǎn)觸發(fā)同源定向修復(fù)或染色體易位，以鞏固有益的等位基因或打破不良的遺傳連接。HR，同源重組。

Box 1. 不使用外源 DNA 的植物基因組編輯

不使用外源 DNA 的植物基因組編輯優(yōu)于傳統(tǒng)的基因組編輯，因?yàn)樗a(chǎn)生的脫靶突變較少，并減少了法定監(jiān)管問題。雖然基因組整合的外源序列可以通過雜交消除，但未檢測(cè)到的載體片段可能會(huì)殘留在基因組中，而且雜交對(duì)于無性繁殖的物種來說并不現(xiàn)實(shí)。一些使用 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白或 mRNA 的出色研究表明，基因編輯可以在水稻¹¹、萵苣¹¹和小麥^12-13中以無 DNA 的方式進(jìn)行。然而，由于無 DNA 基因組編輯的效率低，且與引入外源選擇標(biāo)記不兼容，因此阻礙了無 DNA 基因組編輯的推廣。解決這些問題的方法之一是創(chuàng)建內(nèi)源可選擇標(biāo)記。由于除草劑靶向基因（如乙酰乳酸合成酶（ALS）基因）中的某些氨基酸取代可賦予其對(duì)除草劑的耐受性，因此用單導(dǎo) RNA 共同靶向感興趣的基因和 ALS，并選擇除草劑抗性，可極大地豐富具有所需編輯的感興趣基因的植物^14-15。如果每種成分都以 RNA 或蛋白質(zhì)形式傳遞，這種可選擇的聯(lián)合編輯策略可促進(jìn)無 DNA 編輯。促進(jìn)無 DNA 基因編輯的另一種方法是使用形態(tài)發(fā)生調(diào)節(jié)劑（Box 2），通過與無 DNA CRISPR-Cas試劑一起傳遞來提高編輯效率，因?yàn)樾螒B(tài)發(fā)生調(diào)節(jié)劑可以促進(jìn)轉(zhuǎn)化體的再生^16-1⁷。隨著未來的發(fā)展，無DNA編輯可能會(huì)成為植物基因組編輯的主要方法。

Figure 3. CRISPR-Cas系統(tǒng)的遞送策略

(a) 將CRISPR-Cas試劑送入植物細(xì)胞。編碼 CRISPR-Cas 試劑（Cas 和單導(dǎo) RNA（sgRNA））或 CRISPR-Cas-sgRNA 核糖核蛋白（RNP）的 DNA 或 RNA 可通過農(nóng)桿菌、納米粒子和生物轟擊等方法送入植物細(xì)胞，這些方法都能穿過堅(jiān)硬的細(xì)胞壁。聚乙二醇（PEG）可以介導(dǎo)植物原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化?？蓪⒕幋a CRISPR-Cas 試劑的 DNA 或 RNA 導(dǎo)入植物病毒的基因組，病毒感染植物細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，并通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到其他細(xì)胞。葉綠體靶向遞送可通過生物轟擊和納米粒子來實(shí)現(xiàn)。

(b) 通過從頭誘導(dǎo)分生組織進(jìn)行基因編輯。首先移除 Cas9 基因表達(dá)植株的分生組織，然后將含有形態(tài)發(fā)生調(diào)節(jié)因子（MR）和 sgRNA 的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物注入修剪位點(diǎn)。形態(tài)發(fā)生調(diào)節(jié)劑可以誘導(dǎo)形成新的基因編輯分生組織，并從新生成的芽中收獲基因編輯植物。

(c) 利用植物 RNA 病毒誘導(dǎo)可遺傳的基因組編輯。將融合了 RNA 移動(dòng)元件的 sgRNA 導(dǎo)入煙草鼠疫病毒（TRV）RNA2。經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)滲入 Cas9 基因表達(dá)植物后，sgRNA 可通過移動(dòng)元件在植物體內(nèi)系統(tǒng)傳播，從而引入可遺傳的誘變。

(d) 通過單倍體誘導(dǎo)系傳遞 CRISPR-Cas。表達(dá)CRISPR-Cas的單倍體誘導(dǎo)系為具有轉(zhuǎn)化能力的植物授粉。受精后，進(jìn)行基因編輯，消除父系基因組中攜帶MATRILINEAL（MTL）基因突變的基因，從而產(chǎn)生優(yōu)良的遺傳背景。通過染色體加倍可以產(chǎn)生同源突變株。

Box 2. 利用形態(tài)發(fā)生調(diào)節(jié)劑促進(jìn)再生

再生是獲得CRISPR-Cas編輯植物的一個(gè)不可避免的核心步驟。然而，目前的再生系統(tǒng)主要依賴組織培養(yǎng)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且依賴物種和基因型。由于再生已成為在植物中應(yīng)用CRISPR-Cas的障礙，形態(tài)發(fā)生調(diào)節(jié)劑已成為應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)的有前途的工具。形態(tài)發(fā)生調(diào)節(jié)因子是一組轉(zhuǎn)錄因子，它們與植物激素一起在分生組織的決定和維持方面發(fā)揮作用并能誘導(dǎo)分生組織形態(tài)發(fā)生和產(chǎn)生胚狀結(jié)構(gòu)。在玉米外植體中同時(shí)過表達(dá)編碼兩種形態(tài)發(fā)生調(diào)節(jié)因BABY BOOM 1 (BBM1)和WUS2的基因，可誘導(dǎo)近交系和不易轉(zhuǎn)化的組織再生出轉(zhuǎn)基因植株¹⁸。由于形態(tài)發(fā)生調(diào)節(jié)因子高度保守，這種方法很容易推廣到其他不可再生的基因型或作物上，如水稻、甘蔗和大豆¹⁵^{, 18-19}。利用形態(tài)發(fā)生調(diào)節(jié)因子，在將CRISPR-Cas和BBM1及WUS2一起送入植物細(xì)胞后，成功地再生出了經(jīng)過基因編輯的難育玉米近交系植株²⁰。然而，由于BBM和WUS2的組成型表達(dá)可能導(dǎo)致發(fā)育異常和不育，因此亟需使用其他形態(tài)發(fā)生調(diào)節(jié)因子的新工具。

Figure 4. 多重基因組編輯策略

(a) 使用一種 Cas 蛋白和多個(gè)單導(dǎo)RNA（sgRNA）進(jìn)行多重基因組編輯。兩個(gè) sgRNA（靶向Cas9）或CRISPR RNA（crRNA；靶向 Cas12a）可同時(shí)用于靶向兩個(gè)（或多個(gè)）不同位點(diǎn)（T1和T2）。

(b) 多重正交基因組編輯策略使用催化不活躍的Cas9（dCas9）和不同的 sgRNA 支架（scRNA）。例如，scRNA1和scRNA2含有不同的RNA合體，可以招募不同的效應(yīng)蛋白，如調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的蛋白或熒光蛋白。

(c) 一種多重正交基因組編輯策略，使用一種Cas蛋白和兩種sgRNA或crRNA，其中一種帶有全長的原核載體，另一種帶有截短的原核載體。全長 sgRNA-T1 或crRNA-T1 以基因1為目標(biāo)，由相應(yīng)的Cas蛋白進(jìn)行刪除。截短的原空間介質(zhì)（tsgRNA-T2或tcrRNA-T2）不支持Cas的全部催化活性，但能使Cas調(diào)節(jié)基因 2 的表達(dá)。

(d) 用Cas的同源物進(jìn)行多重正交基因組編輯。使用正交sgRNA和/或crRNA 支架（未顯示）的Cas9和/或Cas12a的同源物可用于多重正交編輯。效應(yīng)物可以是脫氨酶或基因表達(dá)調(diào)節(jié)劑。不過，在某些情況下可能不需要效應(yīng)物，例如創(chuàng)建基因敲除。

(e) 由單一系統(tǒng)（SWISS）誘導(dǎo)的同步廣泛編輯。MS2的RNA aptamer 用于招募胞苷脫氨酶模塊，boxB用于招募腺苷脫氨酶模塊，成對(duì)的sgRNA 用于創(chuàng)建插入和缺失。boxB，招募 N22p 的 RNA aptamer 發(fā)夾；CBE，胞嘧啶堿基編輯器；ecTadA、ecTadA*，ecTadA變體；esgRNA，增強(qiáng)sgRNA；UGI，尿嘧啶 DNA 糖基化酶抑制劑；MCP，MS2 外殼蛋白；MS2，噬菌體 MS2的RNA aptamer；N22p，親和力增強(qiáng)的噬菌體-λ N肽。

Figure 5. 利用基于 CRISPR-Cas 的技術(shù)定向進(jìn)化抗除草劑基因

(a) 基于CRISPR-Cas9技術(shù)的剪接因子3B亞基1（SF3B1）基因在黑麥草中的定向進(jìn)化，以提高對(duì)剪接抑制劑herboxidiene的抗性。

(b) 利用飽和定向內(nèi)源誘變編輯器（STEME）雙堿基編輯器對(duì)O. sativa乙酰輔酶A羧化酶2（ACC2）基因進(jìn)行定向進(jìn)化，提高水稻的抗除草劑性。PAM，原間隔鄰接基序；sgRNA，單導(dǎo) RNA；WT，野生型。

結(jié)論與展望

CRISPR-Cas已成為改變植物基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究游戲規(guī)則的工具。除了 CRISPR-Cas核酸酶誘導(dǎo)的indel突變外，人們還設(shè)計(jì)了一系列CRISPR-Cas衍生的編輯器，可以對(duì)基因組進(jìn)行精確操作。這些工具具有無與倫比的基因編輯能力，幫助創(chuàng)造了數(shù)以百計(jì)的農(nóng)作物品種，提高了農(nóng)藝性能，并徹底改變了育種技術(shù)。

CRISPR-Cas為在短時(shí)間內(nèi)馴化孤兒作物或野生物種以促進(jìn)全球糧食安全和消除貧困帶來了可能性。與CRISPR-Cas相關(guān)的許多植物生物技術(shù)也得到了開發(fā)或更新，包括促進(jìn)植物基因編輯的傳遞方法；在不同表達(dá)階段進(jìn)行精準(zhǔn)基因調(diào)控的方法；以及實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)基因組編輯、功能基因組學(xué)screening和植物定向進(jìn)化的多重和高通量基因編輯方法。

然而，這些多功能工具還不能滿足植物基因組操作的所有需求，進(jìn)一步開發(fā)對(duì) CRISPR-Cas在植物中的應(yīng)用至關(guān)重要。由于某些農(nóng)業(yè)性狀是多個(gè)數(shù)量性狀位點(diǎn)的產(chǎn)物，編輯單個(gè)基因可能不會(huì)產(chǎn)生足夠的表型變化，因此開發(fā)高效的 CRISPR-Cas介導(dǎo)的定向插入和染色體組重排技術(shù)，以組合或"堆疊"突變等位基因?qū)⑹欠浅Ｓ欣摹Ｓ捎谄茐奶囟ɑ蚩赡軙?huì)帶來適應(yīng)性損失，因此需要在調(diào)控基因表達(dá)和精準(zhǔn)基因組編輯方面取得進(jìn)一步進(jìn)展，以高效、有針對(duì)性地微調(diào)基因功能。此外，由于將某些外源蛋白質(zhì)直接轉(zhuǎn)化到植物中可能存在問題，因此完善CRISPR-Cas衍生的定向進(jìn)化平臺(tái)，使其更適合植物系統(tǒng)將大有裨益。由于CRISPR-Cas試劑的遞送仍是植物基因組編輯的主要障礙，因此開發(fā)更多新型遞送方法是可取的；納米材料（如碳納米管^21-22、DNA納米結(jié)構(gòu)²³和細(xì)胞穿膜肽²⁴）是以各種形式遞送CRISPR-Cas有前途的載體，因?yàn)樗鼈兛梢栽跊]有機(jī)械輔助的情況下擴(kuò)散到有壁的植物細(xì)胞中，且不會(huì)造成組織損傷?；A(chǔ)基因研究也亟需取得進(jìn)展，以確定與特定理想農(nóng)藝性狀相關(guān)的基因。

除上述應(yīng)用外，CRISPR-Cas 還可能被重新用于新的應(yīng)用領(lǐng)域，如編輯線粒體和葉綠體的基因組、追蹤細(xì)胞系以闡明植物發(fā)育的基本模式、構(gòu)建遺傳電路以整合和傳遞信號(hào)、開發(fā)植物生物傳感器以檢測(cè)內(nèi)部和外部信號(hào)，以及植物合成生物學(xué)的其他應(yīng)用?？傊?，CRISPR-Cas技術(shù)無疑已經(jīng)并將繼續(xù)徹底改變農(nóng)業(yè)和植物生物技術(shù)。

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文章來源：原本隨想

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