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心血管健康（Cardiovascular health, CVH）在人的整個(gè)壽命中起著至關(guān)重要的作用，尤其是自年輕成年期開始的心血管健康狀況，與個(gè)體未來心血管疾?。–ardiovascular disease, CVD）的風(fēng)險(xiǎn)及總死亡率有著強(qiáng)烈的相關(guān)性。研究表明，維持理想的心血管健康水平至中年甚至能基本消除剩余的終生CVD風(fēng)險(xiǎn)，并帶來更長的健康壽命，降低全因死亡率和醫(yī)療支出，提高老年時(shí)的生活質(zhì)量。

然而，研究還發(fā)現(xiàn)，心血管健康從兒童時(shí)期到年輕成年期間顯著下降，在到達(dá)中年時(shí)，只有不到5%的美國人能夠保持高水平的心血管健康。因此，預(yù)防成年期心血管健康的損失或中斷不良心血管健康向亞臨床心血管疾病的轉(zhuǎn)變可能在大幅減少CVD發(fā)病率和死亡率方面發(fā)揮重要作用。

DNA甲基化是一種眾所周知的表觀遺傳修飾，它作為環(huán)境暴露的調(diào)節(jié)性修改能影響基因表達(dá)。環(huán)境及生活方式因素已與血液DNA甲基化生物標(biāo)志物的變化相關(guān)聯(lián)，而這些甲基化的變化可能在分子層面上記錄了個(gè)體整體的心血管健康狀態(tài)。這些表觀遺傳變化因此可能代表了心血管健康暴露、基因表達(dá)模式控制以及未來CVD發(fā)展之間的重要潛在生物學(xué)聯(lián)系。

本研究的主要目標(biāo)是明確年輕成年期到中年的累積心血管健康暴露與中年期反復(fù)測量的全基因組DNA甲基化模式之間的關(guān)聯(lián)，進(jìn)一步理解這些表觀遺傳變化是如何介導(dǎo)從較差的心血管健康到亞臨床CVD的過渡。

縱向隊(duì)列研究：使用CARDIA（Coronary Artery Risk Development in Young Adults, 青年冠狀動(dòng)脈風(fēng)險(xiǎn)的發(fā)展研究）研究的數(shù)據(jù)集，其中包括1085名參與者的血液DNA甲基化數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)在15年（Y15）和20年（Y20）的兩次檢測中獲得。此外，采用來自FHS(Framingham Heart Study, 弗萊明翰心臟研究)研究的數(shù)據(jù)集作為數(shù)據(jù)分析時(shí)的對(duì)照組。

臨床CVH評(píng)分定義：結(jié)合體重指數(shù)、血壓、總膽固醇和空腹血糖四項(xiàng)指標(biāo)，從年輕成年期至中年期計(jì)算每位參與者的累積心血管健康分?jǐn)?shù)。

血液DNA甲基化分析：使用來自Illumina因美納公司的Infinium™ MethylationEPIC BeadChip檢測超過840,000個(gè)甲基化標(biāo)記點(diǎn)。

全基因組關(guān)聯(lián)分析（EWAS）：通過多元線性回歸模型，調(diào)整年齡、性別、種族、學(xué)習(xí)中心、教育、技術(shù)批次因素和估計(jì)的血細(xì)胞類型比例等協(xié)變量，以確定與累積CVH評(píng)分相關(guān)的甲基化標(biāo)記。

懲罰性回歸建模：使用懲罰性回歸建立基于甲基化的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（MRS），評(píng)估冠狀動(dòng)脈鈣化和臨床CVD事件的風(fēng)險(xiǎn)。

此實(shí)驗(yàn)方法的特點(diǎn)如下：

覆蓋廣泛：EPIC陣列能夠覆蓋廣泛的基因組區(qū)域，提供大規(guī)模的甲基化數(shù)據(jù)分析。

重復(fù)性高：采用兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的甲基化數(shù)據(jù)提高了發(fā)現(xiàn)的可靠性。

調(diào)整多方面因素：通過調(diào)整多個(gè)協(xié)變量，降低混雜變量影響，提高了結(jié)果的穩(wěn)健性。

縱向研究設(shè)計(jì)：可以評(píng)估時(shí)間相關(guān)的變化和長期風(fēng)險(xiǎn)。

交叉驗(yàn)證：將CARDIA數(shù)據(jù)與FHS數(shù)據(jù)比較，提高研究發(fā)現(xiàn)的普遍性和可信度。

這個(gè)流程圖展示了整個(gè)研究的設(shè)計(jì)和執(zhí)行步驟。其中包括在CARDIA研究中通過EPIC芯片得到甲基化數(shù)據(jù)，并進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析（EWAS）來鑒定與累計(jì)CVH顯著相關(guān)的甲基化標(biāo)記。在FHS中，使用450K芯片的數(shù)據(jù)進(jìn)行交叉驗(yàn)證。此外，還進(jìn)行了多種額外分析以提高CARDIA中心血管健康相關(guān)甲基化標(biāo)記的穩(wěn)健性，如按種族和性別分層分析、敏感性分析、前瞻性分析及CVH與甲基化變化分析。最后，研究人員對(duì)鑒定出的甲基化標(biāo)記進(jìn)行了基因注釋、調(diào)節(jié)標(biāo)記富集和功能分析，并評(píng)估了這些標(biāo)記預(yù)測冠狀動(dòng)脈鈣化風(fēng)險(xiǎn)的潛在臨床應(yīng)用。

表1 提供了CARDIA（Coronary Artery Risk Development in Young Adults, 年輕人冠狀動(dòng)脈風(fēng)險(xiǎn)的發(fā)展研究）和FHS（Framingham Heart Study,弗萊明翰心臟研究）參與者的特性概覽。包含的主要信息是：有 CARDIA的平均年齡在Y15是40歲，在Y20是45歲。相比之下，F(xiàn)HS的Third Generation（第三代）隊(duì)列的平均年齡也是45歲，但年齡范圍更廣（24-71歲）。FHS的Offspring（子代）隊(duì)列的平均年齡是65歲，年齡范圍是更寬的40-90歲。以及其他人口統(tǒng)計(jì)信息，如性別、種族、教育水平、是否過量飲酒、吸煙狀態(tài)、既往疾病史、有關(guān)體育活動(dòng)水平、BMI（體重指數(shù)）、血壓、膽固醇和血糖控制等，也包含在內(nèi)。

圖2中，A和B是兩個(gè)圓形的曼哈頓圖，它們分別展示與年輕成年期到中年期不同時(shí)間點(diǎn)心血管健康（CVH）評(píng)分相關(guān)的DNA甲基化標(biāo)記。在圖2A中，Y15是指在平均年齡40歲時(shí)的數(shù)據(jù)，圖2B中的Y20則代表在平均年齡45歲時(shí)的數(shù)據(jù)。外環(huán)顯示了與累積CVH評(píng)分最相關(guān)的甲基化標(biāo)記，而隨著向內(nèi)環(huán)移動(dòng)，代表越早期的CVH測量時(shí)間點(diǎn)與甲基化評(píng)分的關(guān)聯(lián)。紅色的點(diǎn)表示不同時(shí)間點(diǎn)測量的CVH評(píng)分與甲基化水平之間存在顯著相關(guān)的標(biāo)記。圖中的基因標(biāo)簽表示距離甲基化標(biāo)記最近的基因，顏色的漸變表示這些標(biāo)記與基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)（TSS）的距離。通過此圖，我們可以看出甲基化標(biāo)記與累積CVH之間的相關(guān)性如何隨時(shí)間而增強(qiáng)，同時(shí)還可以識(shí)別出與心血管健康變化關(guān)聯(lián)最緊密的基因。

圖3 提供了對(duì)比分析，檢驗(yàn)心血管健康（CVH）相關(guān)的45個(gè)DNA甲基化位點(diǎn)之間的一致性。這個(gè)一致性是通過這些位點(diǎn)在不同研究中的相關(guān)性系數(shù)（β系數(shù)）表示的。

圖3A 展示了CARDIA研究中的兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)（Y15比Y20）甲基化的β系數(shù)比較。點(diǎn)越靠近圖中的對(duì)角線，表示Y15與Y20測量的甲基化標(biāo)記之間的一致性越高。圖中標(biāo)出的偏離對(duì)角線的點(diǎn)表示Y20時(shí)測量甲基化標(biāo)記的關(guān)聯(lián)性比Y15時(shí)更強(qiáng)。

圖3B 和 圖3C 分別比較了CARDIA研究中的甲基化標(biāo)記與FHS研究的Offspring和Third Generation隊(duì)列中的甲基化標(biāo)記之間的相關(guān)性。高度的一致性表示這些CVH相關(guān)的甲基化標(biāo)記在跨越不同人群和時(shí)間點(diǎn)的研究中都有相似的表現(xiàn)。

圖3D 和 圖3E 使用盒圖展示了這些甲基化標(biāo)記在CARDIA和FHS中每個(gè)時(shí)間點(diǎn)P值（-log10 轉(zhuǎn)換后）的水平，體現(xiàn)隨著時(shí)間的推移、隨著參與者年齡增長，關(guān)聯(lián)性的增強(qiáng)。

這些分析提供了我們研究發(fā)現(xiàn)的渡跨性證據(jù)，以及隨著年齡增長這些甲基化標(biāo)記與CVH之間關(guān)聯(lián)性增強(qiáng)的動(dòng)態(tài)圖景。

圖4 通過Ridge Plot（山脊圖或稱脊線圖）展示了基因富集分析的結(jié)果。圖中展示了根據(jù)基因本體論（GO）富集的最重要幾個(gè)GO術(shù)語的基因-甲基化關(guān)系。GO術(shù)語反映這些基因在細(xì)胞活動(dòng)中的功能。水平的線展示了不同GO術(shù)語對(duì)應(yīng)基因的甲基化標(biāo)記β系數(shù)的分布情況。取正值的β表示在更好的CVH關(guān)聯(lián)下基因甲基化水平偏低（即假設(shè)此甲基化位點(diǎn)與基因表達(dá)為負(fù)相關(guān)時(shí)，基因被上調(diào)），而取負(fù)值則表示這些標(biāo)記在更好的CVH關(guān)聯(lián)下基因甲基化水平偏高（基因被下調(diào)）。

這些分析揭示了在不同的生物學(xué)過程中，DNA甲基化狀態(tài)如何在良好心血管健康狀態(tài)下區(qū)分表現(xiàn)為高度甲基化或低度甲基化。例如，表現(xiàn)為高度甲基化的"細(xì)胞因子產(chǎn)生"和"白細(xì)胞分化"過程可能反映抑制功能，而"胰島素分泌"和"脂質(zhì)代謝"過程中偏低的甲基化與這些功能的激活相關(guān)。

圖5A 顯示了三個(gè)甲基化位點(diǎn)在心血管健康和冠狀動(dòng)脈鈣化（CAC）之間的潛在中介作用。這三個(gè)位點(diǎn)位于SARS1、LINC-PINT和SOCS3基因中，它們的甲基化水平統(tǒng)計(jì)上中介了15年累計(jì)CVH對(duì)CAC風(fēng)險(xiǎn)的20.4%的影響。方向性箭頭α和β表示了CVH與甲基化水平以及甲基化與CAC風(fēng)險(xiǎn)之間的相關(guān)系數(shù)，而中介的比例是通過這些系數(shù)的乘積計(jì)算得出的，即甲基化位點(diǎn)如何在CVH對(duì)CAC風(fēng)險(xiǎn)的總體影響中發(fā)揮了一定的作用。

圖5B 依據(jù)甲基化風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（MRS）將參與者分成三組，并展示了在不同CVH狀態(tài)下參與者發(fā)生CAC的風(fēng)險(xiǎn)。圖中可以看到在中等（5或6分）和差（少于等于4分）CVH分?jǐn)?shù)的個(gè)體中，MRS得分高的組與CAC發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)。而在保持理想CVH狀態(tài)的個(gè)體中，MRS沒有顯著的預(yù)測作用。

圖5C 通過比較接受者操作特征曲線（ROC），檢驗(yàn)了在預(yù)測CAC風(fēng)險(xiǎn)時(shí)僅使用累計(jì)CVH評(píng)分與聯(lián)合使用CVH評(píng)分和MRS的效能。這種分析可以幫助評(píng)價(jià)MRS作為一個(gè)獨(dú)立工具在風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測上的額外價(jià)值。ROC曲線下的面積（AUC）從0.71增加到0.77，說明添加MRS能提高對(duì)CAC狀態(tài)的預(yù)測準(zhǔn)確性。

圖5 顯示了心血管健康（CVH）相關(guān)的甲基化標(biāo)記在臨床應(yīng)用方面的潛在價(jià)值，強(qiáng)調(diào)了將甲基化標(biāo)記轉(zhuǎn)化為預(yù)測心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的工具的可行性，表明基于甲基化的指標(biāo)能夠補(bǔ)充傳統(tǒng)的心血管健康評(píng)分并提供更精準(zhǔn)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，這可能在臨床預(yù)防策略和早期干預(yù)中發(fā)揮重要作用。

表2 展示了在CARDIA開發(fā)的基于甲基化的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（MRS）與緊隨其后在FHS中心血管事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)。表中所示的每一分MRS增加，心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)比例（hazard ratio, HR）表明MRS與未來心血管疾病事件的發(fā)生呈正相關(guān)，即MRS分?jǐn)?shù)越高，發(fā)生心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)越大。此數(shù)據(jù)支持了將MRS作為一個(gè)可能有用的工具來評(píng)估心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)。