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1990年，Norman Iscove課題組，使用PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)cDNA分子的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增，首次證實(shí)對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析是可行的[1]。

20世紀(jì)90年代初期，Eberwine等人發(fā)明了一種新技術(shù)，能夠從單個(gè)活神經(jīng)元細(xì)胞中獲得cDNA，并且再以這些cDNA為模板轉(zhuǎn)錄生成RNA，實(shí)現(xiàn)RNA的線性擴(kuò)增[2]。

2008年發(fā)展出了高通量RNA測(cè)序技術(shù)（二代測(cè)序），隨后科研人員將高通量測(cè)序技術(shù)與之前發(fā)展起來(lái)的核酸擴(kuò)增技術(shù)結(jié)合起來(lái)，對(duì)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了更加精細(xì)的研究。最早出現(xiàn)的單細(xì)胞RNA擴(kuò)增方法結(jié)合二代測(cè)序方出現(xiàn)在2009年，即Tang’s method[3] 。

Tang方法利用PCR進(jìn)行擴(kuò)增會(huì)引入大量擴(kuò)增副產(chǎn)物，2012年Sten Linnarsson實(shí)驗(yàn)室在《Cell Report》發(fā)表了CEL-seq技術(shù)，他將線性擴(kuò)增的方法替代PCR反應(yīng)[4]。

從此，越來(lái)越多修飾和改進(jìn)的單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)被開(kāi)發(fā)出來(lái)，引入了在樣本收集、單細(xì)胞捕獲、條形碼逆轉(zhuǎn)錄、cDNA擴(kuò)增、文庫(kù)制備、測(cè)序和生物信息學(xué)分析等方面的必要修飾和改進(jìn)。最重要的是，成本顯著降低，而自動(dòng)化和通量顯著提高。

scRNA-seq的通量從幾個(gè)細(xì)胞增加到數(shù)十萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，而成本大大降低，這得益于scRNA-seq技術(shù)的快速發(fā)展，如基于微流控、微孔、液滴的技術(shù)以及原位條形碼和空間轉(zhuǎn)錄組分析等。

scRNA-seq的步驟主要包括單細(xì)胞分離和捕獲、細(xì)胞裂解、反轉(zhuǎn)錄、cDNA擴(kuò)增和文庫(kù)制備（。單細(xì)胞捕獲、反轉(zhuǎn)錄和cDNA擴(kuò)增是文庫(kù)制備步驟中最具挑戰(zhàn)性的部分。隨著多種測(cè)序平臺(tái)的發(fā)展，RNA-seq文庫(kù)制備技術(shù)也呈現(xiàn)出快速而多樣化的發(fā)展。因此，了解不同單細(xì)胞RNA測(cè)序文庫(kù)制備方法的特點(diǎn)和應(yīng)用，以便在科學(xué)研究中做出適當(dāng)?shù)倪x擇，更好地將這些技術(shù)應(yīng)用于臨床。

單細(xì)胞分離和捕獲是從組織中捕獲高質(zhì)量的單個(gè)細(xì)胞的過(guò)程，從而提取精確的遺傳和生化信息，并促進(jìn)獨(dú)特的遺傳和分子機(jī)制的研究。組織塊（bulk）樣本傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組、表觀基因組或蛋白質(zhì)組只能捕獲來(lái)自組織/器官的整體信號(hào)，無(wú)法區(qū)分單個(gè)細(xì)胞的變異。單細(xì)胞的分離和捕獲方法因生物體、組織或細(xì)胞特性而有很大的不同。細(xì)胞分離可以通過(guò)分離整個(gè)細(xì)胞、細(xì)胞特異性的細(xì)胞核或細(xì)胞特異性細(xì)胞器，甚至分離表達(dá)特異性標(biāo)記蛋白的細(xì)胞來(lái)完成。最常見(jiàn)的單細(xì)胞分離和捕獲技術(shù)包括有限稀釋、熒光激活細(xì)胞分選（FACS）、磁珠激活細(xì)胞分選、微流控系統(tǒng)和激光顯微切割。單個(gè)捕獲的關(guān)鍵結(jié)果，特別是在高通量中，是每個(gè)單細(xì)胞被捕獲在一個(gè)孤立的反應(yīng)混合物中，其中單個(gè)細(xì)胞的所有轉(zhuǎn)錄本將被加上唯一的條形碼轉(zhuǎn)換為cDNA。

在將RNA轉(zhuǎn)化為第一鏈cDNA后，得到的cDNA可以通過(guò)PCR或體外轉(zhuǎn)錄（IVT）進(jìn)行擴(kuò)增。PCR作為非線性擴(kuò)增過(guò)程應(yīng)用在Smart-seq、Smart-seq2、Fluidigm C1、Drop-seq、10x Genomics、MATQ-seq、Seq-Well和DNBelab C4。目前存在兩種PCR擴(kuò)增策略。一種采用SMART技術(shù)，利用Moloney鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的轉(zhuǎn)移酶和鏈轉(zhuǎn)換活性，整合模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸作為接頭進(jìn)行下游PCR擴(kuò)增。該方法是目前最常用的cDNA擴(kuò)增方法。另一種策略是將cDNA的5’端與poly（A）或poly（C）連接，以在PCR反應(yīng)中構(gòu)建通用的接頭。IVT是另一種擴(kuò)增方法和線性擴(kuò)增過(guò)程，用于CEL-seq、MARS-Seq和inDrop-seq方法中。它需要對(duì)擴(kuò)增的RNA進(jìn)行額外一輪的逆轉(zhuǎn)錄，這會(huì)導(dǎo)致額外的3’端覆蓋偏倚性。這兩種方法都可能導(dǎo)致擴(kuò)增偏倚。為了克服擴(kuò)增相關(guān)的偏倚性，在反轉(zhuǎn)錄步驟中引入獨(dú)特的分子標(biāo)記（UMI）對(duì)細(xì)胞內(nèi)的每個(gè)單個(gè)mRNA分子加上條形碼，從而提高scRNA-seq的定量性質(zhì)，并通過(guò)有效消除PCR擴(kuò)增偏倚提高了讀取精度。

單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)在過(guò)去十年中已被證明是生命科學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)革命性技術(shù)。高通量單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)和計(jì)算工具的發(fā)展，使得該技術(shù)在生命科學(xué)中的幾乎所有應(yīng)用領(lǐng)域都可獲得和應(yīng)用。單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)的一個(gè)重要基礎(chǔ)知識(shí)是在組織、器官和有機(jī)體中構(gòu)建單細(xì)胞圖譜。為此，在研究和建立細(xì)胞圖譜方面作出了相當(dāng)大的努力，全身單細(xì)胞圖譜已經(jīng)應(yīng)用于秀麗隱桿線蟲(chóng)、渦蟲(chóng)、黑腹果蠅、斑馬魚(yú)、小鼠、獼猴和人類(lèi)。隨著技術(shù)和應(yīng)用的發(fā)展，預(yù)計(jì)將產(chǎn)生越來(lái)越多的單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)，并將其集成到一個(gè)可公開(kāi)訪問(wèn)的數(shù)據(jù)庫(kù)中，以促進(jìn)了解基因和細(xì)胞在健康和疾病中的功能。