簡(jiǎn)介
單克隆抗體在生物制藥領(lǐng)域越來(lái)越受歡迎，在發(fā)現(xiàn)潛在有效的治療性單抗的研發(fā)過(guò)程中，需要篩選大量的候選單抗。因此需要準(zhǔn)確、快速和高通量的檢測(cè)方法用于定量IgG和含F(xiàn)c片段蛋白?，F(xiàn)有的IgG/Fc片段定量方法包括：HPLC、表面干涉法、ELISA和TR-FRET，這些方法存在一些缺點(diǎn)，比如有的價(jià)格昂貴、有的耗費(fèi)勞動(dòng)力和時(shí)間。
Valita TITER方法為直接在細(xì)胞培養(yǎng)上清中檢測(cè)和定量IgG和含F(xiàn)c片段蛋白提供了一種非常精準(zhǔn)且經(jīng)濟(jì)高效的解決方案。該方法采用熒光偏振技術(shù)檢測(cè)IgG和Fc片段與G蛋白的相互作用，線性檢測(cè)范圍為2.5至100mg/L。分析在96孔板中進(jìn)行，提供簡(jiǎn)單、高通量、快速且全自動(dòng)化處理，樣品量要求低，無(wú)需繁瑣的制備過(guò)程。
在本應(yīng)用指南中，我們介紹了在Spark®和Infnite® 200PRO多功能酶標(biāo)儀上使用Valita TITER試劑盒定量檢測(cè)IgG/Fc-蛋白的優(yōu)化方案。
Spark多功能酶標(biāo)儀是Tecan的一款高端儀器，可以提供多種配置。采用先進(jìn)的模塊化可升級(jí)設(shè)計(jì)，可以輕松地處理常規(guī)和復(fù)雜的檢測(cè)。Spark獨(dú)特的Fusion Optics是第一款將單色儀的靈活性與濾光片的靈敏度結(jié)合在同一臺(tái)儀器內(nèi)的解決方案。這種高度多功能性設(shè)計(jì)確保了實(shí)驗(yàn)研發(fā)和優(yōu)化，即使在低信號(hào)范圍內(nèi)也可以實(shí)現(xiàn)熒光檢測(cè)應(yīng)用的高靈敏度。
Infinite PRO是一款操作方便的多功能酶標(biāo)儀，最常用的檢測(cè)模式如光吸收、熒光和化學(xué)發(fā)光，提供經(jīng)濟(jì)且高性能的檢測(cè)。該平臺(tái)一直致力于追求卓越，已經(jīng)發(fā)展為一個(gè)經(jīng)濟(jì)實(shí)用的酶標(biāo)儀家族，包含了六種以應(yīng)用劃分的配置。在Infinite 200 PRO上使用Valita TITER試劑盒，應(yīng)選擇Infinite F Plex配置。
實(shí)驗(yàn)原理
Valita TITER是一種快速、高通量的檢測(cè)方法，它通過(guò)熒光偏振法（FP）對(duì)IgG-Fc與IgG結(jié)合肽的相互作用進(jìn)行測(cè)定。
熒光偏振法可以有效地分析分子大小的變化。當(dāng)熒光標(biāo)記分子受到平面偏振光激發(fā)，發(fā)射出相同偏振平面的光，則分子在整個(gè)激發(fā)態(tài)中保持靜止。相反，如果分子在激發(fā)態(tài)中旋轉(zhuǎn)并翻轉(zhuǎn)出該偏振平面，會(huì)發(fā)射出與激發(fā)光不同平面的光。小分子在溶液中的翻滾速度比大分子快，因此可以使用光的去極化程度來(lái)測(cè)量與熒光團(tuán)相關(guān)的分子大小的變化。
在本實(shí)驗(yàn)中，沒(méi)有發(fā)生結(jié)合的帶熒光標(biāo)記的多肽與發(fā)生結(jié)合的IgG-多肽相比，轉(zhuǎn)動(dòng)更快并且去偏振更多（大五倍）?？赏ㄟ^(guò)計(jì)算偏振激發(fā)光源的平行面（偏振部分）和垂直面（去偏振部分）中發(fā)射的光強(qiáng)度之間的歸一化差來(lái)計(jì)算，通常以毫偏振單位（mP）表示。
材料和方法
• ValitaTITER 試劑盒
• ValitaAPP 軟件
• IgG 標(biāo)準(zhǔn)品(人血清)
• Spark 多功能酶標(biāo)儀
• Infinite 200 PRO 多功能酶標(biāo)儀(F Plex 配置)
實(shí)驗(yàn)步驟
根據(jù)使用說(shuō)明書準(zhǔn)備樣品。按照Valita TITER 試劑盒說(shuō)明繪制8點(diǎn)IgG標(biāo)準(zhǔn)曲線。簡(jiǎn)單地說(shuō)，在Valita TITER微孔板的每個(gè)孔中加入60 l Valita Mab重組緩沖液以及60 l標(biāo)準(zhǔn)品?；靹虮芄夥跤?0分鐘后，在Spark和Infnite 200 PRO酶標(biāo)儀中，分別采用Spark Control™和i-control™預(yù)置的方案進(jìn)行檢測(cè)，參數(shù)設(shè)定詳見(jiàn)表1。然后使用Valita APP 軟件對(duì)導(dǎo)出的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
G因子用來(lái)補(bǔ)償光學(xué)組件對(duì)平行和垂直偏振光的不同響應(yīng)。G因子計(jì)算是熒光偏振測(cè)量中一個(gè)重要的因素。雖然它可以手動(dòng)設(shè)置，建議在開始樣品測(cè)量之前對(duì)FP測(cè)試中使用的特定熒光基團(tuán)執(zhí)行一個(gè)G因子校準(zhǔn)。
G因子與波長(zhǎng)相關(guān)，方法中至少需要一個(gè)包含熒光基團(tuán)的微孔（參照），和一個(gè)只包含緩沖溶液沒(méi)有任何熒光基團(tuán)的微孔（空白參照）。一旦為一個(gè)特定的熒光基團(tuán)計(jì)算出G因子，這個(gè)值可以用于以后所有相同熒光基團(tuán)的測(cè)量。
結(jié)果
在Spark和In?nite 200 PRO酶標(biāo)儀上使用ValitaTITER試劑盒定量檢測(cè)得到8點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線（從2.5到100mg/L），顯示了多次測(cè)量間的低差異性。
將Valita TITER法與被廣泛認(rèn)為是金標(biāo)準(zhǔn)的HPLC法的結(jié)果做比較（圖4）。HPLC法和Valita TITER法的相關(guān)性顯示這兩種方法的精度類似，而Valita TITER法由于其同質(zhì)性不需要復(fù)雜的樣品制備，更加快速、高通量和操作簡(jiǎn)單。
結(jié)論
實(shí)驗(yàn)表明Spark和In?nite 200 PRO展出優(yōu)秀的分析性能，提供了一個(gè)定量IgG和含F(xiàn)c片段蛋白的高通量、易操作和低成本的解決方案。此外，該方法直接測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液，不再需要復(fù)雜的樣品制備步驟。
（文章來(lái)源：hmez.huimeihealth.com.cn/）
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