簡介
蛋白質(zhì)之間的動態(tài)相互作用是多種細(xì)胞功能的關(guān)鍵媒介，幾乎與所有的生物過程都相關(guān)。因此，它們是研發(fā)新型藥物治療的有價值靶點。在這種背景下，Promega開發(fā)的生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（BRET）是一種成熟的檢測技術(shù)，用于研究活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)相互作用。然而，由于其有限的動態(tài)范圍和靈敏度，其應(yīng)用推廣至今仍受到一定的阻礙。
隨著最新的極其明亮的NanoLuc®熒光素酶的出現(xiàn)，用其與一種帶有長波長熒光團(tuán)的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合的標(biāo)記方法， P r o m e g a 將B R E T 技術(shù)帶到了一個新的水平：NanoBRET™。
由于其尺寸?。?9 kDa）、發(fā)射強(qiáng)度高且光譜（460nm峰值強(qiáng)度）相對狹窄，NanoLuc®熒光素酶成為理想的能量供體。一種高效紅光發(fā)光受體熒光團(tuán)（635nm峰值強(qiáng)度）使整個BRET光譜分離超過175nm（見圖1）。相比其他BRET分析技術(shù)，它整合了更大的光強(qiáng)度與改進(jìn)的光譜分辨率，因此顯著提高了檢測結(jié)果的靈敏度，并使其達(dá)到了更高的動態(tài)范圍 [1]
NanoBRET™靶位結(jié)合細(xì)胞內(nèi)HDAC試驗，測試的是完整細(xì)胞內(nèi)可與選定目標(biāo)HDAC蛋白結(jié)合的化合物的親和力，該化合物可競爭性地取代細(xì)胞中與NanoLuc®融合蛋白可逆結(jié)合的NanoBRET™示蹤劑。隨著最新的極其明亮的NanoLuc®熒光素酶的出現(xiàn)，用其與一種帶有長波長熒光團(tuán)的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合的標(biāo)記方法， P r o m e g a 將B R E T 技術(shù)帶到了一個新的水平：NanoBRET™。
在試驗的第一步，向表達(dá)所需NanoLuc®融合蛋白的細(xì)胞中加入固定濃度的示蹤劑。競爭性化合物的引入導(dǎo)致NanoBRET™能量轉(zhuǎn)移的劑量依賴性下降，以此估計靶蛋白的胞內(nèi)親和力。NanoBRET™TE細(xì)胞內(nèi)HDAC試驗評估化合物與組蛋白去乙?；福℉DAC）—NanoLuc熒光素酶融合蛋白[2]的結(jié)合。在本應(yīng)用指南中，我們在Spark多功能酶標(biāo)儀上演示了用于評估化合物與HDAC6（一種與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和腫瘤發(fā)生相關(guān)的組蛋白去乙?；福┙Y(jié)合的方法。
Spark酶標(biāo)儀是Tecan公司的多模塊檢測平臺，可為基于發(fā)光的檢測應(yīng)用提供卓越的性能，包括閃光和輝光發(fā)光、多色發(fā)光和發(fā)光掃描[3,4]。專用光電倍增管（PMT）允許單光子計數(shù)，消除了通常與使用單個PMT進(jìn)行熒光和發(fā)光測量的儀器相關(guān)聯(lián)的靈敏度和動態(tài)范圍之間的沖突。這種獨特的光學(xué)組合成就了優(yōu)越的靈敏度，可與獨立的光度計相媲美。該酶標(biāo)儀配備了專門針對NanoBRET應(yīng)用的優(yōu)化升級款發(fā)光濾片。
本應(yīng)用指南總結(jié)了使用Spark酶標(biāo)儀和NanoBRET檢測技術(shù)實施NanoBRET™靶位結(jié)合細(xì)胞內(nèi)HDAC試驗的一系列測試結(jié)果。
材料和方法
• HEK293細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)HDAC6-NanoLuc®融合蛋白
• NanoBRET™ TE細(xì)胞內(nèi)HDAC檢測試劑盒（Promega,Cat# N2080）
• 包括NanoBRET™Nano-Glo®底物，示蹤稀釋緩沖液，NanoBRET™細(xì)胞內(nèi)TE HDAC示蹤劑，和細(xì)胞外NanoLuc®抑制劑
• Opti-MEM® I減血清培養(yǎng)基，無酚紅（Fisher, cat#11058021）
• SAHA （亞?；桨妨u肟酸）/ Vorinostat（Sigma, cat#
SML0061, 配制為10mM DMSO原液）
• Panobinostat （Selleck Chemicals, cat# S1030, 配制為10mMDMSO原液）
• Costar® #3917 96孔白色帶蓋組織培養(yǎng)處理板（Fisher, cat#07-Spark-628）
• 各種單通道和多通道移液器和槍頭，移液槽
將HEK293細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)HDAC6-NanoLuc®融合蛋白在不含血清或酚紅的Opti-MEM培養(yǎng)基中重懸至密度為2x105個/mL。將85μl的細(xì)胞懸液（17,000個細(xì)胞/孔）轉(zhuǎn)移到康寧實驗板的孔中。將80 μl的NanoBRET™細(xì)胞內(nèi)TE HDAC示蹤劑和320 μl的示蹤稀釋緩沖液結(jié)合制成20X NanoBRET™示蹤劑，在所有實驗孔中加入5 μl的NanoBRET™示蹤劑。
將10mM原液含有Panobinostat和亞?；桨妨u肟酸（SAHA）測試化合物在Opti-MEM中稀釋至200 μM，然后在Opti-MEM中按1:3連續(xù)滴定，形成10X濃度11-pt劑量反應(yīng)滴定。將稀釋后的化合物10 μl一式三份加入實驗孔中。不含化合物的對照孔中也添加10 μl培養(yǎng)基。
將檢測板以700轉(zhuǎn)/分的速度混勻振蕩15秒，然后置于37°C/5% CO2培養(yǎng)箱中孵育85分鐘。
孵育后，將測定板從培養(yǎng)箱中取出，使其在室溫下平衡15分鐘。
在室溫平衡過程中，將30 μl的NanoBRET™Nano-Glo®底物和10 μl的胞外NanoLuc®抑制劑與4.96 ml不含血清或酚紅的Opti-MEM結(jié)合制成3X完整底物加抑制劑溶液。在所有實驗孔中加入50μl 該3X完整底物加抑制劑溶液。
將檢測板以700轉(zhuǎn)/分的速度混勻振蕩15秒，然后在室溫下孵育2分鐘，然后測量NanoBRET。
根據(jù)試劑盒說明書[2]制備NanoBRET TE細(xì)胞內(nèi)HDAC檢測試劑盒并移液到Costar白色96孔平底微孔板中，總檢測量為150 μl。在In nite Spark上進(jìn)行檢測的參數(shù)設(shè)置如表1所示。
結(jié)果和討論
使用Spark對每個微孔依次讀取供體和受體波長。手工計算BRET比值，將比值結(jié)果乘以1000轉(zhuǎn)換為milliBRET單位（mBU）。
已知的HDAC抑制劑Panobinostat和SAHA都會與HDAC6結(jié)合，導(dǎo)致BRET比值的劑量依賴性變化。高濃度的兩種化合物取代了細(xì)胞內(nèi)的HDAC示蹤劑，導(dǎo)致BRET[3]降低。測得Panobinostat和SAHA的EC50值分別為1.42 μM和0.54 μM（見圖3）。隨著藥物濃度的稀釋，對示蹤劑結(jié)合的競爭變得不那么明顯。較低濃度的化合物取代較少的示蹤劑，使得供體NanoLuc®熒光素酶和示蹤劑之間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。
總之，供體（NanoLuc®熒光素酶）和受體（示蹤劑）的發(fā)光信號過濾后的波長均可被檢測到。因此，Spark多功能酶標(biāo)儀是適用于NanoBRET™檢測的。
參考文獻(xiàn)
1) Machleit et al. NanoBRET–A novel BRET platform for
the analysis of protein-protein interactions. ACS Chem.
Biol., 2015, 10 (8), pp 1797–1804
2) NanoBRET™ Target Engagement Intracellular HDAC
Assay. Technical Manual/Instructions for Use. 6/16,
TM483 (Promega)
3) Unparalleled flexibility for luminescence detection wit h
the Spark™ multimode reader. Technical Note. 398597
V2.0. 01-2017 (Tecan)
4) Spark® multimode reader - luminescence sensitivity.
Optimizing the detection limits for flash and glo w
luminescence. Technical Note. 398751 V2.0. 01-2 017
(Tecan)
5) Implementation of NanoBRET assay technology the
Infinite 200. Application Note. 400193 V1.0 04 -2017
(Tecan)
（文章來源：hmez.huimeihealth.com.cn/hm/scrm/scrmmobile/eda/1654307552964694016）
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