簡(jiǎn)介
對(duì)于許多細(xì)胞生物學(xué)應(yīng)用，例如識(shí)別和分離高表達(dá)的克隆或敲除候選基因以及小規(guī)模生產(chǎn)抗體或蛋白，確保細(xì)胞株來源于單個(gè)細(xì)胞即其單克隆性非常重要。這可能是一個(gè)主要瓶頸過程尤其對(duì)于學(xué)術(shù)型實(shí)驗(yàn)室，由于自動(dòng)化顯微鏡昂貴且操作復(fù)雜，單克隆性的驗(yàn)證通常使用顯微鏡手動(dòng)進(jìn)行。
Tecan新的Spark®多功能酶標(biāo)儀具有集成的明場(chǎng)成像模塊，可使用一次性Cell Chips™（細(xì)胞芯片）進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和活力分析。它可以對(duì)6至96孔微孔板板型孔內(nèi)的細(xì)胞匯合度進(jìn)行無標(biāo)記物的實(shí)時(shí)評(píng)估，檢測(cè)細(xì)胞覆蓋區(qū)域，并計(jì)算相對(duì)匯合度。該成像功能由SparkControl™軟件中直觀易用的匯合度分析應(yīng)用程序完成，通過用戶自定義模式提供準(zhǔn)確的檢測(cè)（圖1）。該功能專為中低通量的應(yīng)用而設(shè)計(jì)，可在終點(diǎn)或動(dòng)力學(xué)模式下進(jìn)行匯合度檢測(cè)，40分鐘內(nèi)可以完成96孔板的檢測(cè)。用戶可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，選擇孔內(nèi)的不同區(qū)域（圖2），可以是每個(gè)孔中心的圖像，或者一系列并排的圖像形成的全孔成像。該軟件可以自動(dòng)進(jìn)行孔邊界檢測(cè)，以彌補(bǔ)微孔板尺寸引起的差異。
本應(yīng)用指南介紹了使用Spark酶標(biāo)儀利用自動(dòng)成像、半自動(dòng)圖像分析和數(shù)據(jù)縮減，以經(jīng)濟(jì)有效的方式對(duì)96孔板中的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和微孔成像、驗(yàn)證細(xì)胞單克隆性。
材料和方法
細(xì)胞接種和生長
HEK293細(xì)胞生長至70-90%匯合度，加入胰蛋白酶消化，并在正常培養(yǎng)基中重懸至10個(gè)細(xì)胞/ml的濃度。使用Spark酶標(biāo)儀的細(xì)胞計(jì)數(shù)模塊測(cè)定細(xì)胞濃度和活力（1）。將100 μl細(xì)胞重懸液鋪至平底96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的每個(gè)孔中。陽性對(duì)照則是將1E+04個(gè)細(xì)胞接種到微孔板的每個(gè)孔中。細(xì)胞每3-4天換液一次，直到細(xì)胞在每個(gè)孔中達(dá)到20-30%的匯合度（約需17天）。
成像采集和分析
在接種后4小時(shí)進(jìn)行圖像采集，這時(shí)細(xì)胞輕微貼壁在孔的底部，此后每周進(jìn)行一次成像，直到細(xì)胞達(dá)到預(yù)期的匯合度。SparkControl軟件的設(shè)置包括全孔成像、孔邊緣檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析，每個(gè)孔采集20張圖像后整合在一起。使用全孔成像和孔邊緣檢測(cè)確?？梢詸z測(cè)到沉降在孔邊緣的單個(gè)細(xì)胞。使用“包含數(shù)據(jù)分析”功能時(shí)，系統(tǒng)會(huì)同時(shí)保存原始圖像和處理后的圖像。
為了保證在圖像采集過程中細(xì)胞具有最佳活力，使用酶標(biāo)儀的環(huán)境控制模塊，將檢測(cè)室維持在37°C和5% CO2的環(huán)境中。Tecan的濕度盒的同時(shí)使用可以避免培養(yǎng)基蒸發(fā)。該系統(tǒng)的蓋子升降器會(huì)在檢測(cè)過程中自動(dòng)移開濕度盒的蓋子（不是培養(yǎng)板蓋），確保實(shí)驗(yàn)過程中的無菌環(huán)境。
為了鑒定細(xì)胞的生長，在Day 17手動(dòng)篩選經(jīng)自動(dòng)分析的全孔圖像中匯合度超過10%的。然后通過原始圖像將陽性孔手動(dòng)回溯到Day 1，鑒定單細(xì)胞克隆。注意：沒有經(jīng)過匯合度評(píng)估的原始圖像用于手動(dòng)評(píng)估，高質(zhì)量的圖像可以非常容易地識(shí)別單個(gè)細(xì)胞。
結(jié)果
圖3 顯示一個(gè)具有鑒定的單細(xì)胞克隆的代表性的HEK293孔。
討論和結(jié)論
該實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示了Spark酶標(biāo)儀的細(xì)胞計(jì)數(shù)和微孔成像模塊結(jié)合SparkControl軟件應(yīng)用于中低通量的半自動(dòng)克隆成像和單克隆性驗(yàn)證的能力。該系統(tǒng)可以獲得高質(zhì)量的圖像，在超過1,000多個(gè)孔的實(shí)驗(yàn)分析中僅出現(xiàn)一次自動(dòng)聚焦誤差。在第17天自動(dòng)分析的匯合度水平成功地用于鑒定細(xì)胞菌落，然后目視檢查并確定這些細(xì)胞是否來自單細(xì)胞克隆。該方法的成功表明，Spark酶標(biāo)儀作為一種理想的低成本解決方案，可以取代通過顯微鏡進(jìn)行的繁瑣的手動(dòng)單克隆性驗(yàn)證。
參考文獻(xiàn)
(1) Fast and accurate cell counting in a multimodemicroplate reader, 398570 V1.0. 12-2014
（文章來源：hmez.huimeihealth.com.cn/hm/scrm/scrmmobile/eda/1654361814799675392） | 
