簡介
轉染是研究生物學功能過程中不可或缺且經(jīng)常使用的實驗方法。因此，在大多數(shù)實驗中，為了確保細胞樣本適合下游應用，對細胞轉染效率進行定性和定量評估，是一個常見且重要的實驗環(huán)節(jié)。這項工作通常會涉及到熒光標記的使用，如綠色熒光蛋白（GFP）。
通常研究者會使用熒光顯微鏡或單細胞分析技術，如流式細胞術，但是這種方法需要將細胞從培養(yǎng)皿中分離出來，對轉染效率進行人工評估，而活細胞成像技術可以在原位對細胞表達進行分析。
Tecan新推出的Spark®Cyto多功能酶標儀，內(nèi)部整合了一臺精密相機，可直接對酶標板中的細胞樣品進行明場和熒光成像，并由功能強大且易使用的SparkControl™軟件進行控制。SparkControl軟件能夠提供多種預定義的應用方案，并具有用戶自定義功能，可以滿足不同操作者的需求，使用靈活簡便。
SparkControl中的轉染效率應用程序針對GFP轉染細胞進行了優(yōu)化，可配合使用藍色核染料，如Hoechst 33342或DAPI（見圖1）。
該軟件根據(jù)染色的藍色細胞核自動檢測單個細胞，并識別出那些顯示額外綠色熒光的細胞，從中計算并實時顯示轉染效率百分比。
材料與方法
將親代和GFP轉染的中國倉鼠卵巢細胞（分別是CHO和CHO- GFP）置于含10% FBS的Ham 's F-12培養(yǎng)基（Gibco， # 11765054）中， 于37℃，5% CO2的潮濕條件下進行培養(yǎng)。
用胰蛋白酶/EDTA處理并收集兩種細胞系細胞，計數(shù)準確的細胞數(shù)量。將已知的不同混合比例的轉染和非轉染細胞種到96孔板來模擬不同轉染效率的樣品，每孔200 μl總數(shù)10,000個細胞（表1）。這些細胞在熒光染色和圖像采集前被靜置一夜。
檢測前，所有細胞由 0.01 mg/ml的Hoechst 33342（Thermo Scienti?c）避光室溫染色30分鐘。
使用轉染效率應用程序進行細胞成像，參數(shù)設置如表2所示。在本實驗中，使用了4倍物鏡和全微孔成像模式，不僅如此，這些參數(shù)還可以根據(jù)特定的孔板和圖像分辨率要求而變化。圖像采集參數(shù)分別為兩個顏色通道進行了優(yōu)化，如LED強度、對焦補償和曝光時間等。當使用多個熒光標記時，必須糾正串色，因此含綠色標記細胞的參考孔也包含在內(nèi)。
除了成像分析外，還通過對同一孔進行多點測量的方式，從底部記錄GFP信號的熒光強度。
多功能檢測和熒光成像能力的結合，使得細胞樣品的可視化和功能性檢測能夠在同一實驗中順利完成。
結果
圖2顯示了使用Spark Cyto的轉染效率應用程序自動獲取并評估的代表性圖像。
熒光成像測定的轉染效率與熒光強度測量結果相關，在整個稀釋范圍內(nèi)，兩者呈良好的線性關系（見圖3）。
結論
Spark Cyto多功能酶標儀非常適合活細胞成像和細胞檢測。本技術手冊中的實驗結果證實，為標準成像應用預定義的實驗方案是確定細胞特征（比如：轉染效率）便捷且可靠的工具。它包含的無縫銜接的實驗方法設置、自動化處理以及結果的綜合評價，能幫助研究者輕而易舉地計算出每個樣本的轉染效率比。
（文章來源：hmez.huimeihealth.com.cn/hm/scrm/scrmmobile/eda/1654366202039160832） | 
