簡介
細胞凋亡——或程序性細胞死亡——是許多生物學過程的核心組成部分，包括發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)、免疫系統(tǒng)的成熟和維持。因此，識別與區(qū)分凋亡細胞、死細胞和活細胞，在眾多生物學研究領域中顯得非常重要。
熒光激活細胞分選（FACS）是區(qū)分凋亡細胞、壞死細胞和活細胞最常用且成熟的方法之一。然而，它需要對大量胰蛋白酶消化細胞進行分析，并且通常需要針對多個微孔板進行不同時間點或不同模式的檢測。
在健康細胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）位于細胞膜內側。在細胞凋亡的早期，PS外翻是細胞被吞噬的標志信號。一旦PS翻轉到細胞膜外側，可被與熒光標記（如異硫氰酸熒光素（FITC）或Alexa Fluor®488）結合的鈣依賴性磷脂結合蛋白annexin V檢測到。添加第二種不滲透細胞的染料，如碘化丙啶（PI），可以區(qū)分壞死細胞，PI能夠透過死細胞的細胞膜而使細胞核染色。PI和FITC/Alexa Fluor 488聯(lián)合使用是區(qū)分細胞培養(yǎng)中凋亡和壞死的標準流程。在這種情況下，早期凋亡細胞為annexin V探針信號較強和PI的熒光信號較弱或觀察不到熒光信號，而晚期凋亡細胞為annexin V和PI雙探針均呈現(xiàn)較強的熒光信號，如圖1所示。細胞總數(shù)可以通過核染色確定，如Hoechst 33342或DAPI（4′，6-二氨基-2-苯基吲哚）等細胞核探針。
Spark Cyto全自動實時活細胞檢測系統(tǒng)將酶標儀的多功能檢測能力與精密的成像功能巧妙的整合在一起，可直接在微孔板中對細胞樣本進行明場和熒光成像檢測。與此同時，功能強大且易用的SparkControl™ 軟件能夠提供大量的預定義程序，極大簡化了基于細胞的常見檢測分析過程。
本文通過使用細胞死亡應用程序，用于評估A431人鱗狀上皮癌細胞經(jīng)細胞毒性劑處理后的細胞死亡情況。檢測過程中，使用了SparkCyto的熒光成像模塊對PI、annexinV、Hoechest 33342進行了熒光成像拍攝。
材料和方法
細胞培養(yǎng)
A431 細胞 (ATCC® No. CRL-1555) 在37°C和5% CO2的潮濕條件下，在DMEM高糖生長培養(yǎng)基（Sigma）中生長至約70-80%的細胞密度，該培養(yǎng)基補充有L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、青霉素/鏈霉素、HEPES和5%熱滅活胎牛血清（FCS、PAA實驗室）。然后收集細胞，計數(shù)并接種到底部透明的96孔黑色組織培養(yǎng)板（Tecan，3012306）中。在200ul培養(yǎng)基中，每孔的密度為7500個細胞。將培養(yǎng)板過夜培養(yǎng)，使細胞貼壁。
誘導凋亡
星孢菌素是一種有效的凋亡誘導劑[1]，使用兩種不同濃度的星孢菌素（#S5921，Sigma-Aldrich）誘導細胞凋亡。簡而言之，從孔中吸取培養(yǎng)基，添加含有0、1、2μM 星孢菌素的新鮮培養(yǎng)基，細胞在37°C和5% CO2條件下培養(yǎng)6小時。吸取含有星孢菌素的培養(yǎng)基，在進行染色步驟之前，用PBS清洗細胞兩次。
染色方法
根據(jù)說明書，將Alexa Fluor488標記了的Annexin V（#13201，Thermo Scienti?c）與PI結合使用，以區(qū)分細胞膜破裂的細胞。用Hoechst 33342溶液（#62249，ThermoScienti?c）對細胞進行染色，以識別單個細胞核。
染色溶液由以下成分組成：
• 97 μl 1X 結合液
• 1 μl annexin V-Alexa Fluor 488
• 1 μl PI (0.1 mg/ml stock)
• 1 μl Hoechst 33342 (1 mg/ml stock)
將染色溶液添加到所有實驗孔中，并在光保護條件下培養(yǎng)15分鐘。未經(jīng)處理的對照組和僅用annexin V或PI染色的對照孔，用于信號串色校正。
每個細胞系的特定熒光圖譜可能存在不同，應分別進行優(yōu)化和建立。此外，應針對每個細胞系和細胞毒性劑優(yōu)化最佳染色條件和分析時間。
圖像采集與分析
本實驗采用SparkControl軟件熒光成像的預定義細胞死亡應用程序進行實驗。使用10倍物鏡，拍攝每個孔藍色、綠色和紅色熒光通道的孔中心圖像。儀器的參數(shù)設置見表1。使用單獨染色的對照孔進行串色校正。
與所有預定義的SparkControl應用一樣，分析步驟也是預定義的，可以通過以下參數(shù)識別并量化研究對象：
• 帶有綠色或紅色信號的藍色對象（%）（即帶有藍色和綠色或藍色和紅色熒光對象的百分比）
• 帶有綠色信號的藍色對象
• 帶有紅色信號的藍色對象
• 帶有綠色和紅色信號的藍色對象
• 沒有綠色或紅色信號的藍色對象
結果
Spark Cyto的圖像采集結果顯示，根據(jù)細胞核的Hoechst染色情況，可以清晰地對A431細胞進行區(qū)分。此外，經(jīng)星孢菌素處理的annexin V-Alexa Fluor 488（綠色）和PI熒光（紅色）均呈陽性，這表明誘導了細胞凋亡（如圖2所示）。
細胞死亡應用分析程序是基于所有三種熒光信號的鄰近相關（共定位）效應，它能夠幫助識別和區(qū)分活細胞、凋亡細胞和壞死細胞。SparkControl軟件能夠獨特地識別以下對象：
• 藍色對象 – 細胞核
• 藍色/綠色對象 – 早期凋亡細胞
• 藍色/紅色細胞 – 壞死細胞
• 藍色/紅色/綠色對象 – 晚期凋亡細胞
這使得用戶可以從數(shù)據(jù)中獲得最大的信息量，以便更恰當?shù)亟忉寣嶒灲Y果。
A431細胞經(jīng)過添加1μM星孢菌素處理后，可導致約50%細胞死亡。而對于使用2μM星孢菌素處理的細胞樣本，結果顯示其死亡率進一步增加（圖3）。
即使在沒有誘導細胞死亡的情況下，一定數(shù)量的細胞可能會對不同標記物呈陽性。由于所選細胞系的不同及細胞聚集效應，細胞凋亡的基線水平會存在很大差異。因此，通過研究未經(jīng)處理的對照細胞（無化合物介導的細胞死亡誘導）來確定這些基線水平顯得非常重要。
結論
Spark Cyto的熒光成像功能非常適用于各類細胞檢測分析。SparkControl軟件中的細胞死亡應用程序，可以有效簡化針對使用常用染料染色的凋亡細胞和壞死細胞的檢測分析過程。
此外，該系統(tǒng)能夠提供全面的環(huán)境控制，包括溫度、氣體和濕度等，以確保細胞樣本在整個分析期間都處于理想狀態(tài)。
參考文獻
1) Oberdanner et al. Glucose is required to maintain highATP-levels for the energy-utilizing steps during PDTinducedapoptosis. Photochem Photobiol, 2002; 76(6),695-703.
（文章來源;hmez.huimeihealth.com.cn/hm/scrm/scrmmobile/eda/1654386208906989568） | 
