簡介
細(xì)胞表型（包括形態(tài)和分子特征）的動(dòng)態(tài)變化監(jiān)測對于揭示環(huán)境刺激或基因干擾下的細(xì)胞響應(yīng)的機(jī)制至關(guān)重要。雖然許多分子標(biāo)記物（如細(xì)胞表面標(biāo)記物，報(bào)告蛋白或小分子）可以用于單細(xì)胞表型，但這些分析通常是在單一預(yù)定終點(diǎn)進(jìn)行的。
常見的基于流式細(xì)胞術(shù)的方法需要終止實(shí)驗(yàn)而獲取細(xì)胞群，由于使用長時(shí)間和勞動(dòng)密集型的步驟，因而妨礙了對細(xì)胞表型變化的實(shí)時(shí)和動(dòng)態(tài)分析。然而，細(xì)胞狀態(tài)的變化是動(dòng)態(tài)的，并且在許多情況下，細(xì)胞表型發(fā)生改變的開始時(shí)間和分子變化的事件是未知的。因此，終點(diǎn)分析并不能準(zhǔn)確描述表型變化及其程度，可能產(chǎn)生令人困惑的結(jié)果。
相比之下，在單細(xì)胞水平上的動(dòng)態(tài)測量可以確定表型改變的動(dòng)力學(xué)，以及短暫和長期改變之間的分化，還有助于識(shí)別環(huán)境刺激、適應(yīng)性反應(yīng)和間接效應(yīng)之間的潛在因果聯(lián)系。通常，這些測量主要是在報(bào)告細(xì)胞系/菌株中進(jìn)行的，需要對感興趣的生物進(jìn)行基因修飾。不幸的是，目前可以在任何感興趣的時(shí)間點(diǎn)執(zhí)行、允許動(dòng)態(tài)和連續(xù)監(jiān)測、并適用于廣泛生物系統(tǒng)的混合讀取的分析方案非常少。
對單個(gè)細(xì)胞的可靠識(shí)別（細(xì)胞圖像分割）是在單細(xì)胞水平上量化表型標(biāo)記物的一項(xiàng)重要任務(wù)。細(xì)胞核在所有活細(xì)胞中普遍存在，其一致的球形形狀以及多個(gè)DNA結(jié)合熒光團(tuán)的可用性使細(xì)胞核成為熒光顯微鏡圖像中染色和隨后分割細(xì)胞的理想特征。
由于細(xì)胞核在細(xì)胞內(nèi)的中心位置，即使是緊密相鄰的細(xì)胞也很容易區(qū)分，這為定義具有胞質(zhì)或胞膜定位的標(biāo)記物的二次檢測區(qū)域提供了基礎(chǔ)。藍(lán)色熒光染料（如DAPI，Hoechst染料）是常用的核探針，用于與其他標(biāo)記目標(biāo)表型的熒光探針進(jìn)行多重檢測，包括綠色熒光FITC偶聯(lián)物，紅色熒光TRITC偶聯(lián)物和死細(xì)胞染色劑（如碘化丙啶）。
DNA結(jié)合熒光分子的反復(fù)暴露和激發(fā)可導(dǎo)致光毒性DNA損傷，阻礙活細(xì)胞在較長時(shí)間內(nèi)的連續(xù)成像。通常認(rèn)為光毒性是長時(shí)間熒光成像廣泛應(yīng)用的一項(xiàng)關(guān)鍵限制，但高靈敏度熒光顯微鏡的持續(xù)改進(jìn)為降低核探針的劑量和毒性提供了新的可能性。
本應(yīng)用指南系統(tǒng)地描述了應(yīng)用Spark Cyto進(jìn)行活細(xì)胞的核染色并在重復(fù)曝光和連續(xù)熒光成像期間保持最小的細(xì)胞毒性的實(shí)驗(yàn)參數(shù)，以及使用Spark Control™和Image Analyzer™軟件進(jìn)行可靠的自動(dòng)細(xì)胞圖像分割。優(yōu)化的程序用于多重三色實(shí)驗(yàn)，以識(shí)別和區(qū)分凋亡性細(xì)胞死亡的早期和晚期階段，為動(dòng)態(tài)長期表型的追蹤奠定了基礎(chǔ)。
材料與方法
細(xì)胞培養(yǎng)。人類癌癥細(xì)胞株A549、MDA-MB-468和UO-31來自美國國家癌癥研究所（NCI, Bethesda, MD,U S ）。細(xì)胞保持在R P M I - 1 6 4 0 細(xì)胞培養(yǎng)液中（##21870076，Thermo Fisher Scienti?c），并添加5%透析胎牛血清（#F0392，Sigma Aldrich）， 2 mM 谷氨酰胺（#25030024，Thermo Fisher Scienti?c）和1% 青霉素/鏈霉素溶液（#15140122，Thermo Fisher Scienti?c）。
染料和熒光探針。核染色采用Hoechst 33342（10mg/ml， #H3570，Thermo Fisher Scienti?c）。如下所述稀釋貯存液，并補(bǔ)充到生長細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中。在黑暗環(huán)境（37°C，5% CO2）中初始孵育30分鐘后開始成像。Apo Tracker Green （200 nM，Bio Legend）是一種與暴露在細(xì)胞表面的磷脂酰絲氨酸（PS）殘基結(jié)合的探針，用于檢測早期凋亡細(xì)胞。與能和PS結(jié)合的annexin V相反，Apo Tracker Green的結(jié)合不依賴鈣，可用于低鈣的細(xì)胞培養(yǎng)基，如RPMI -1640。用終濃度為0.5 μg/ml的活細(xì)胞不滲透的染料碘化丙啶（PI，Sigma Aldrich，#P4864）鑒定細(xì)胞膜受損的溶解/壞死和晚期凋亡細(xì)胞。
細(xì)胞凋亡的藥理誘導(dǎo)。用5 - 氟尿嘧啶（ 5 - F U ，#F6627，Sigma Aldrich）處理貼壁細(xì)胞，誘導(dǎo)其生長抑制和凋亡。將粉末溶解在0.1 M NaOH中，無菌過濾后，稀釋在細(xì)胞培養(yǎng)基中，獲得50 mM的儲(chǔ)備液。
明場和熒光成像。細(xì)胞在低匯合度（20-30%）接種到處理后的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Nunclon™Delta表面處理細(xì)胞培養(yǎng)板，#167008，Thermo Scienti?c），并在37°C和5%的CO2中培養(yǎng)過夜使細(xì)胞附著。在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，將三種熒光探針平行添加到每孔中進(jìn)行藥物處理。在初始孵育30-45分鐘使核染色平衡后，將孔板插入Spark Cyto進(jìn)行連續(xù)孵育（37°C，5% CO2）并進(jìn)行自動(dòng)熒光成像。使用Spark Control創(chuàng)建一個(gè)固定3小時(shí)間隔的動(dòng)態(tài)循環(huán)程序，包括使用多色應(yīng)用程序的進(jìn)行熒光成像，和使用2X物鏡和匯合度應(yīng)用程序的分析細(xì)胞匯合度。在這兩種模式下，使用自動(dòng)邊界檢測對整個(gè)微孔進(jìn)行成像。
選擇4X物鏡和多色應(yīng)用程序進(jìn)行熒光成像的實(shí)時(shí)圖像分析。選擇藍(lán)、綠和紅熒光和明場通道，曝光時(shí)間分別為，藍(lán)色熒光（Hoechst 33342）60 ms，綠色熒光（Apo Tracker Green）150 ms，紅色熒光（PI）200 ms。多色分析的設(shè)置根據(jù)核染色（Hoechst 33342，一級掩膜）和兩項(xiàng)額外的次級掩膜，半徑為 14 m并激活 Voronoi掩模選項(xiàng)。為優(yōu)化綠色和紅色信號的檢測參數(shù)，設(shè)置綠色和紅色熒光強(qiáng)度閾值分別為0.02和0.01RFU。核計(jì)數(shù)和每組細(xì)胞占比（即藍(lán)+/綠+、藍(lán)+/紅+或藍(lán)+/綠+/紅+）在Spark Control中對每個(gè)時(shí)間點(diǎn)實(shí)時(shí)分析，并能以Microsoft Excel®格式導(dǎo)出便于后續(xù)分析和可視化處理。
數(shù)據(jù)分析。圖1-3中的數(shù)據(jù)圖是在Matlab 2018b中生成的。圖3c-f所示的動(dòng)力學(xué)參數(shù)是直接從動(dòng)態(tài)測量和圖像分析中導(dǎo)出的。對于每個(gè)濃度的5-FU，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間（72小時(shí)）的所有時(shí)間點(diǎn)上觀察到藍(lán)色和綠色信號的細(xì)胞的最大百分比來確定早期凋亡細(xì)胞的最大占比（圖3c）。為了表示晚期凋亡和細(xì)胞死亡（圖3d），我們測定了不同劑量5-FU 在72小時(shí)出現(xiàn)藍(lán)色和紅色信號的細(xì)胞比例。凋亡的開始（圖3e）定義為觀察到藍(lán)色和綠色信號的細(xì)胞比例最大的時(shí)間（圖3c）。為了估計(jì)細(xì)胞凋亡率（圖3f），定義為藍(lán)色和綠色信號細(xì)胞分?jǐn)?shù)每小時(shí)增加的最大值，將藍(lán)色和綠色細(xì)胞比例的動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)分成20個(gè)重疊部分，每個(gè)部分包含5個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)（15小時(shí)），利用Matlab函數(shù)進(jìn)行線性擬合計(jì)算斜率（細(xì)胞% / 小時(shí)）。圖3f顯示觀察到的20個(gè)時(shí)間點(diǎn)的最大斜率（凋亡細(xì)胞%/小時(shí)）。
結(jié)果與討論
優(yōu)化長期活細(xì)胞成像的核染色
細(xì)胞核是所有活細(xì)胞的基本組成部分，明確的功能特征使其成為熒光成像中自動(dòng)檢測細(xì)胞和單個(gè)細(xì)胞核的理想工具（圖1a）。除了細(xì)胞計(jì)數(shù)，熒光圖像還可以在單細(xì)胞水平上進(jìn)行多水平表型表征，通過定義二級掩膜，為每個(gè)單個(gè)細(xì)胞分配二級測量細(xì)胞表型的報(bào)告分子。為了研究這種多色成像試驗(yàn)中的核染色，我們探索了細(xì)胞滲透性藍(lán)色熒光染料Hoechst 33342對長期成像的適應(yīng)性，以及多路復(fù)用綠色和紅色熒光探針的可能性。
盡管與細(xì)胞核DNA選擇性緊密結(jié)合的特征使Hoechst33342成為一種強(qiáng)有力的核染料，但也可能會(huì)導(dǎo)致染料分子在細(xì)胞核中大量聚集。其在紫外線（UV）光譜范圍內(nèi)被激發(fā)，這加劇了光毒性DNA損傷的風(fēng)險(xiǎn)。因此，本研究旨在尋找在低光毒性條件下有效的核染色實(shí)驗(yàn)條件，通過最小化Hoechst 33342的濃度來減少核染色的風(fēng)險(xiǎn)。
為了確定Hoechst 33342的最佳濃度，在不同濃度對貼壁生長人類癌癥細(xì)胞染色，細(xì)胞的匯合度（代表細(xì)胞活率）和藍(lán)色目標(biāo)計(jì)數(shù)連續(xù)監(jiān)測96小時(shí)，動(dòng)態(tài)周期設(shè)置固定時(shí)間間隔為2小時(shí)。終點(diǎn)分析法常用的檢測的濃度范圍從31ng/ml到1μg/ml，使用確定對細(xì)胞活率和細(xì)胞圖像分割的影響。我們選擇了三種人類癌癥細(xì)胞株，A549肺癌、MDA-MB-468乳腺癌和UO-31腎癌，來評估潛在的細(xì)胞類型特異的靈敏度和成像特性。
細(xì)胞匯合度數(shù)據(jù)顯示，在存在Hoechst 33342時(shí)所有三種類型細(xì)胞的生長均受到強(qiáng)烈的濃度依賴性抑制。這出現(xiàn)在最初的24小時(shí)（圖1b），與之前報(bào)道的長期活細(xì)胞成像中的光毒性一致。雖然Hoechst 33342濃度的降低能解決對所有三個(gè)細(xì)胞系在細(xì)胞生長上的負(fù)面影響，但一個(gè)關(guān)鍵問題是，如此低的濃度是否仍然可以進(jìn)行細(xì)胞核圖像分割。
為了取得細(xì)胞核分割和毒性之間的最佳平衡，在長期孵育期間，系統(tǒng)地比較了不同濃度Hoechst 33342下動(dòng)態(tài)增加的細(xì)胞數(shù)量（圖1c），這由細(xì)胞匯合度和藍(lán)色目標(biāo)計(jì)數(shù)決定。在最佳染色條件下，預(yù)期細(xì)胞匯合度和藍(lán)色目標(biāo)計(jì)數(shù)的相對增加是一致的，并且與未染色培養(yǎng)組中細(xì)胞匯合度的動(dòng)態(tài)增加相匹配。然而在所有的細(xì)胞系里使用非常低和非常高濃度的未染色對照中觀察到大的偏離， 同時(shí)發(fā)現(xiàn)在MDA-MB-468細(xì)胞和UO-31細(xì)胞中62.5和125ng/ml濃度的Hoechst 33342導(dǎo)致藍(lán)色目標(biāo)計(jì)數(shù)（圖1c中第2和3行）與細(xì)胞匯合度數(shù)據(jù)一致。這表明能實(shí)現(xiàn)符合要求的細(xì)胞核分割。
對A549細(xì)胞，濃度稍高是最合適的，250ng/ml的濃度對生長沒有負(fù)面影響，核計(jì)數(shù)直到培養(yǎng)達(dá)到完全匯合（大約48小時(shí)）都是可靠的（圖1c中第1行）。A549中低劑量的Hoechst 33342縮短了藍(lán)色目標(biāo)計(jì)數(shù)充分反映細(xì)胞匯合度數(shù)據(jù)的時(shí)間窗口。這表明可能會(huì)由于熒光強(qiáng)度低，對細(xì)胞核的識(shí)別不完全。
形態(tài)上的差異（圖1d）可能是由于不同細(xì)胞類型特異性最佳濃度略有不同。球形MDA-MB468細(xì)胞的細(xì)胞核區(qū)較密集，需要較低的濃度就能達(dá)到可靠分割的信號閾值。相比之下，A549細(xì)胞形狀扁平，意味著核體積分布在更大的區(qū)域，這降低了像素強(qiáng)度，可能導(dǎo)致核分割的靈敏度相對較低。
總的來說，結(jié)果表明在不影響分割質(zhì)量的情況下，Hoechst 33342濃度降低8倍是可能的。與傳統(tǒng)染色方案相比，有機(jī)會(huì)解決光毒性問題。
(a) 細(xì)胞核的熒光標(biāo)記允許使用細(xì)胞圖像分割分法在熒光圖像中定位單個(gè)細(xì)胞。
(b) 在增加DNA結(jié)合核染料Hoechst 33342濃度的情況下，三種不同癌細(xì)胞系的細(xì)胞匯合度的動(dòng)態(tài)監(jiān)測。圖像由Spark Cyto在4倍放大倍數(shù)下獲取，并使用匯合度應(yīng)用程序?qū)崟r(shí)分析細(xì)胞的匯合度（細(xì)胞所覆蓋的微孔面積百分比）。(c) 根據(jù)細(xì)胞匯合度（黑色線條）和藍(lán)色目標(biāo)計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)（核計(jì)數(shù)，藍(lán)色線條）以及在未染色細(xì)胞培養(yǎng)中測量的細(xì)胞匯合度（空心黑色線條）重建的生長動(dòng)態(tài)。
(d) A549、MDA-MB-468和UO-31細(xì)胞用125 ng/mL的Hoechst 33342染色后的明場和藍(lán)色熒光圖像，顯示了不同的形態(tài)和細(xì)胞核區(qū)域。所有圖像都是在Spark Cyto中以4倍放大倍數(shù)獲取。為了便于觀察，增強(qiáng)了藍(lán)色熒光圖像中的對比度。
三色分析法在原位貼壁細(xì)胞培養(yǎng)中檢測早期凋亡
Spark Cyto采用三色熒光成像方法原位檢測凋亡細(xì)胞，結(jié)合使用優(yōu)化后的核染色步驟和二級標(biāo)記物。細(xì)胞凋亡是程序性細(xì)胞死亡的一種形式，是一種與健康和疾病密切相關(guān)的標(biāo)志性細(xì)胞表型。凋亡性細(xì)胞死亡是發(fā)育的組成部分，包括組織穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)，也具有阻止疾病進(jìn)展的有利藥理作用。
存在不同的熒光探針來檢測已經(jīng)在早期階段（1，2）誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，包括結(jié)合外源磷脂酰絲氨酸（PS）殘基的熒光團(tuán)偶聯(lián)蛋白，例如膜聯(lián)蛋白annexins。由于探針接近靶標(biāo)不需要膜滲透，因此該方法只需通過簡單地將探針添加到細(xì)胞培養(yǎng)基中來原位標(biāo)記活細(xì)胞。
最常用的膜聯(lián)蛋白（annexin V）需要鈣離子的存在才能有效結(jié)合PS， 本研究選擇了Apo Tracker™Green（Biolegend）。這種最近開發(fā)的探針可以不依賴Ca2+結(jié)合（3），并能在低鈣的環(huán)境和培養(yǎng)基（例如RPMI-1640）中檢測PS易位。為了區(qū)分凋亡和壞死細(xì)胞的死亡機(jī)制（圖2a），碘化丙啶作為細(xì)胞不滲透的熒光探針，僅在膜完整性受損時(shí)與細(xì)胞DNA結(jié)合，表明細(xì)胞溶解和死亡。膜完整性的喪失也發(fā)生在凋亡的后期，導(dǎo)致Apo Tracker Green和碘化丙啶同時(shí)標(biāo)記的細(xì)胞出現(xiàn)。
該方法無需額外的樣品操作就能檢測細(xì)胞藥理學(xué)凋亡。A549肺癌細(xì)胞用500 μM 5-FU處理，然后加入Hoechst33342、Apo Tracker Green和碘化丙啶，在Spark Cyto的受控環(huán)境（37°C, 5% CO2）中孵育，42小時(shí)后得到明場和熒光圖像（圖2b-c）。使用Spark Control中的多色應(yīng)用程序，根據(jù)二級標(biāo)記自動(dòng)對Hoechst 33342陽性細(xì)胞進(jìn)行多色分類：
(a)實(shí)驗(yàn)原理概述。用低濃度Hoechst 33342染色活細(xì)胞的細(xì)胞核，在藍(lán)色熒光圖像中分割細(xì)胞核。在細(xì)胞核周圍一定半徑處定義二級分割掩模（黃色圓圈）用于測定二級標(biāo)記物。使用Spark Control中的多色應(yīng)用程序，自動(dòng)將染色細(xì)胞分類為活細(xì)胞（僅標(biāo)記核）、早期凋亡細(xì)胞（Apo Tracker Green+）、晚期凋亡細(xì)胞（Apo Tracker Green+/碘化丙啶+）或溶解細(xì)胞（碘化丙啶+）。用5-FU處理A549肺癌細(xì)胞(b)的凋亡與未處理的對照組(c)比較。在Spark Cyto中用4倍放大獲取明場、藍(lán)色、綠色和紅色熒光圖像。
• 活細(xì)胞（無二次染色）；
• 早期凋亡細(xì)胞（Apo Tracker Green+）；
• 晚期凋亡細(xì)胞 （Apo Tracker Green+ 和碘化丙啶+）；
• 溶解細(xì)胞/壞死細(xì)胞（碘化丙啶+）。
在5-FU處理的細(xì)胞（13,179±636藍(lán)色目標(biāo)）和對照組（5,927±191藍(lán)色目標(biāo)）之間觀察到細(xì)胞核數(shù)量的巨大差異，這與細(xì)胞匯合度（分別為46±2%和71±5%）的巨大差異一致。在5 - F U 處理的細(xì)胞培養(yǎng)中， 早期凋亡細(xì)胞（Apo Tracker Green+）的比例也顯著升高，占所有檢測到的細(xì)胞核的20±1%，而在未處理的對照組中為0.7±0.6%。
此外，在加入5-FU 的42小時(shí)后，可以看到一小部分處于凋亡晚期階段的細(xì)胞（Apo Tracker Green+/ 碘化丙啶+），占細(xì)胞總數(shù)的28±1%，而在未處理對照組中則不到1%。在5-FU處理的培養(yǎng)物中，僅碘化丙啶染色的溶解細(xì)胞很少見，而在未處理的培養(yǎng)物中則不存在（分別為3±0%和0±0%）?？傊Y(jié)果表明三色分析法能準(zhǔn)確檢測和區(qū)分活細(xì)胞培養(yǎng)中的早期和晚期凋亡。
全自動(dòng)實(shí)時(shí)監(jiān)測細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)
優(yōu)化后的三色分析法用于動(dòng)態(tài)監(jiān)測5-FU劑量依賴性誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。A549肺癌細(xì)胞在96孔板3復(fù)孔用增加劑量的5-FU處理后，在Spark Cyto中72小時(shí)監(jiān)測活細(xì)胞、早期和晚期凋亡細(xì)胞以及壞死細(xì)胞的比例和細(xì)胞匯合度。為了動(dòng)態(tài)進(jìn)行熒光成像和多色分析，Spark Control里設(shè)計(jì)固定3小時(shí)間隔的動(dòng)態(tài)循環(huán)程序，以獲取明場、藍(lán)色、綠色和紅色熒光圖像并進(jìn)行實(shí)時(shí)圖像分析。
PS殘基從細(xì)胞膜的內(nèi)表面易位到外表面是細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡后的早期事件，發(fā)生在細(xì)胞膜完整性喪失之前，因此Apo Tracker Green染色被認(rèn)為先于碘化丙啶染色。隨著凋亡性細(xì)胞死亡的發(fā)展，細(xì)胞經(jīng)歷膜完整性的喪失，導(dǎo)致出現(xiàn)一批晚期凋亡細(xì)胞，這些細(xì)胞同時(shí)表現(xiàn)Apo Tracker Green和碘化丙啶染色。細(xì)胞匯合度分析顯示，濃度低至5μM的5-FU處理時(shí)可導(dǎo)致強(qiáng)烈的生長抑制，而在濃度高于250μM時(shí)，隨著時(shí)間的推移，可以觀察到細(xì)胞匯合度明顯減少（圖3a），可能表示細(xì)胞萎縮和脫離。熒光成像和多色分析證實(shí)隨著5-FU濃度的增加，其毒性逐漸加重。當(dāng)濃度低于100μM時(shí)，生長抑制占主導(dǎo)，細(xì)胞死亡很少，早期凋亡迅速增加，ApoTracker Green+細(xì)胞在高劑量5-FU時(shí)大約24小時(shí)開始出現(xiàn)（圖3b）。在早期凋亡細(xì)胞出現(xiàn)這個(gè)早期高峰后，ApoTracker Green+/ 碘化丙啶+晚期凋亡細(xì)胞急劇增加（圖3b），這與細(xì)胞凋亡的快速發(fā)展相一致。
總的來說，動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)證明了凋亡誘導(dǎo)過程中預(yù)期的事件過程，同時(shí)揭示了5-FU促凋亡作用的強(qiáng)劑量效應(yīng)關(guān)系。加上早期凋亡細(xì)胞的最大百分比和晚期凋亡/死亡細(xì)胞的最大百分比（分別為圖3c和3d），誘導(dǎo)凋亡的時(shí)間和速率也強(qiáng)烈依賴于5-FU的濃度（圖3e-f）。在預(yù)定義的終點(diǎn)測量往往只能提供一個(gè)瞬時(shí)快照，而動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)允許查看細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)過程的任何動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
(a-b) A549細(xì)胞使用不同劑量的5-FU處理，并加入Hoechst 33342、ApoTracker Green和碘化丙啶。在Spark Cyto中使用動(dòng)態(tài)循環(huán)程序（間隔3小時(shí)）和匯合度程序和多色應(yīng)用程序進(jìn)行72小時(shí)的細(xì)胞匯合度（圖a）和凋亡誘導(dǎo)（圖b）的動(dòng)態(tài)監(jiān)測。
(c-f) 誘導(dǎo)凋亡的動(dòng)力學(xué)參數(shù)呈濃度依賴性關(guān)系，包括早期凋亡細(xì)胞的最大百分比（圖c），72小時(shí)后晚期凋亡細(xì)胞和死亡細(xì)胞的百分比（圖d），早期凋亡的發(fā)生，即早期凋亡細(xì)胞分?jǐn)?shù)達(dá)到最大值的時(shí)間（圖e），以及早期凋亡率，即描述早期凋亡細(xì)胞增加的最高斜率（早期凋亡細(xì)胞每小時(shí)百分比，圖f）。所有參數(shù)均來自圖b中的動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)。
結(jié)論
動(dòng)態(tài)跟蹤細(xì)胞表型和生理學(xué)改變的方法為基礎(chǔ)研究和藥物發(fā)現(xiàn)應(yīng)用中的細(xì)胞群的詳細(xì)功能表征鋪平了道路。雖然破壞性和勞動(dòng)密集型實(shí)驗(yàn)方式，主要基于流式細(xì)胞術(shù)測量，迄今為止限制了表型測量的可擴(kuò)展性和通量，但活細(xì)胞成像技術(shù)的最新發(fā)展重新點(diǎn)燃了開發(fā)動(dòng)態(tài)和長期成像和表型跟蹤實(shí)驗(yàn)程序的動(dòng)力。本應(yīng)用指南描述了通過使用低濃度的常見核染料Hoechst 33342來解決光毒性問題的優(yōu)化細(xì)胞核染色系統(tǒng)性方案。Spark Cyto中強(qiáng)大的全孔熒光成像技術(shù)，結(jié)合Spark Control和Image Analyzer中靈敏的分割算法，允許將這種染色方案用于長期活細(xì)胞成像，以及與其他熒光探針進(jìn)行多重檢測，以評估復(fù)雜的細(xì)胞表型，如細(xì)胞凋亡。
Spark Control可實(shí)施定時(shí)自動(dòng)明場和熒光成像，無需用戶干預(yù)，多色應(yīng)用程序可實(shí)時(shí)定量顯示不同表型的細(xì)胞百分比，具有出色的重復(fù)性?？傮w而言，Spark Cyto為細(xì)胞表型的動(dòng)態(tài)跟蹤提供了一個(gè)理想的平臺(tái)，并在預(yù)定的終點(diǎn)提供細(xì)胞表型的動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)編碼機(jī)制的相關(guān)信息，而不僅僅是靜態(tài)快照。
參考文獻(xiàn)
[1] Banfalvi G.Methods to detect apoptotic cell death. Apoptosis,2017,22(2),306-323.
[2] Smith BA,Smith BD.Biomarkers and molecular probes for|cell death imaging and targeted therapeutics.Bioconjug Chem,2012,23(10),1989- 2006.
[3] Barth ND,et al.A fluorogenic cyclic peptide for imaging and quantification of drug-induced apoptosis.Nat Commun.2020, 11(1),4027.
（文章來源：hmez.huimeihealth.com.cn/hm/scrm/scrmmobile/eda/1654414933828620288） | 
