材料
• Spark Cyto 600 全自動實時活細(xì)胞成像檢測系統(tǒng)，包含濕度盒 （Tecan）
• D300e 微量加樣器 （Tecan）
• Real Time-Glo™ MT 細(xì)胞活力試劑盒（Promega）
• HeLa 細(xì)胞 （ATCC）
• Jurkat 細(xì)胞 （RIKEN BRC）
• Greiner 384 孔白色透明底聚苯乙烯細(xì)胞培養(yǎng)微孔板（cat #：781098）
• Greiner 384孔白色聚苯乙烯細(xì)胞培養(yǎng)微孔板（cat #：781075）
• 臺盼藍(lán)，二甲基亞砜
方法
• 設(shè)定Spark Cyto 細(xì)胞培養(yǎng)條件: 37 °C ，5 % CO2
• 將MT細(xì)胞活力底物、NanoLuc®酶和細(xì)胞培養(yǎng)基孵育至37℃
• 用臺盼藍(lán)染色HeLa或Jurkat細(xì)胞并計算活細(xì)胞數(shù)
• 將細(xì)胞懸浮液稀釋至25或125個活細(xì)胞/l，并以40l/孔（1000或5000個細(xì)胞/孔）的濃度將其接種在384孔板中，在37℃的CO2培養(yǎng)箱中過夜
說明
• 通過單獨的實驗提前確定合適的細(xì)胞接種密度
• 細(xì)胞接種可以選擇單通道或多通道手持加樣器或自動化解決方案，如Tecan Fluent® 自動化工作站
• 空孔使用無菌水填充，減少樣品蒸發(fā)
• 準(zhǔn)備5X RealTime-Glo試劑用于在培養(yǎng)基中稀釋MT細(xì)胞活力底物和NanoLuc 酶
• 每個孔中加入10l 5X Real Time-Glo試劑，并輕輕混合。
• 在37 °C和5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30-60分鐘。注：無菌水和小型濕度盒提前預(yù)熱至37°C
• 使用D300e T8+分配盒移液溶解在DMSO中的化合物，劑量范圍從0到1M，并使每個孔中DMSO的總體積歸一化。注：快速移液以減小溫度波動
• 在Spark Cyto中每1小時監(jiān)測1次發(fā)光信號，持續(xù)24-48小時（詳見實驗方法）。注：若在檢測過程中需要向濕度盒中添加無菌水，可提前優(yōu)化實驗方法。
• 導(dǎo)出數(shù)據(jù)并使用Python 3進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。注：數(shù)據(jù)分析可以選擇Excel等其他軟件
結(jié)果和討論
通過明場成像24小時觀察細(xì)胞匯合度，并使用預(yù)置的程序進(jìn)行評估?；衔顰給藥24小時后，細(xì)胞匯合度受到抑制，并呈現(xiàn)劑量依賴性，表明化合物A抑制了細(xì)胞增殖（圖1）。
(A) 使用Spark Cyto獲得的HeLa 細(xì)胞明場圖像 (B) 細(xì)胞匯合度隨時間的變化 (C) 化合物A給藥24小時后的歸一化值（N = 4，mean ± 95 % CI） 使用基于發(fā)光的方法檢測細(xì)胞活力。在0小時的發(fā)光信號定義為陰性對照（圖2A），24小時內(nèi)呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)（圖2B）。與圖1的結(jié)果抑制，化合物A降低了細(xì)胞活力，并呈現(xiàn)劑量依賴性。Spark Cyto的細(xì)胞匯合度和細(xì)胞活力數(shù)據(jù)可用于評估藥物療效。
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