簡(jiǎn)介
細(xì)胞遷移是多細(xì)胞生物發(fā)育和維持的核心過(guò)程，胚胎發(fā)育過(guò)程中的組織形成、傷口愈合和免疫反應(yīng)都需要細(xì)胞的協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)和組裝。細(xì)胞遷移過(guò)程中出現(xiàn)的異常情況與各種疾病有關(guān)——包括癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化和關(guān)節(jié)炎——因此，了解細(xì)胞遷移和觸發(fā)細(xì)胞從一個(gè)位置遷移到另一個(gè)位置的生物事件是研究的重點(diǎn)。
在這種情況下，基于成像的分析方法是研究細(xì)胞遷移的非常有價(jià)值的工具。雖然使用視覺顯微鏡進(jìn)行圖像分析是細(xì)胞生物學(xué)中一種長(zhǎng)期可靠的方法，但它非常耗時(shí)和費(fèi)力。細(xì)胞樣本的自動(dòng)成像分析極大地改善了實(shí)驗(yàn)工作流程并提高了通量，同時(shí)最大限度地減少了由可變起始條件引起的實(shí)驗(yàn)間差異?；趯?shí)時(shí)成像的讀數(shù)可用于在不間斷長(zhǎng)時(shí)間u對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和健康進(jìn)行無(wú)人值守監(jiān)測(cè)。
Tecan 的 Spark 儀器平臺(tái)具有集成的明場(chǎng)細(xì)胞成像模塊，可實(shí)現(xiàn)對(duì)微孔板孔中細(xì)胞匯合度的無(wú)標(biāo)記實(shí)時(shí)評(píng)估。酶標(biāo)儀能夠檢測(cè) 6 至 96 孔板的細(xì)胞覆蓋區(qū)域，并根據(jù)分析區(qū)域計(jì)算相對(duì)匯合率。匯合率還可用于將其他細(xì)胞相關(guān)信號(hào)（例如細(xì)胞 ATP 含量）標(biāo)準(zhǔn)化為樣本中的細(xì)胞數(shù)量。 Spark的匯合成像功能允許研究各種不同形式的細(xì)胞遷移——例如趨化性、遷移和組織侵襲，以及腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。
Radius™ 96 孔細(xì)胞遷移檢測(cè)是一種所謂的“間隙閉合”檢測(cè)系統(tǒng)，它使用定義的無(wú)細(xì)胞區(qū)域，可以重新填充細(xì)胞并通過(guò)視覺或自動(dòng)顯微鏡進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。
與只能在終點(diǎn)進(jìn)行分析的 Boyden 室檢測(cè)不同，Radius檢測(cè)使用專有的細(xì)胞培養(yǎng)板，該培養(yǎng)板帶有一個(gè)由生物相容性水凝膠（Radius 凝膠）在每個(gè)板孔的中心。當(dāng)細(xì)胞在孔中接種時(shí)，它們會(huì)附著在除凝膠點(diǎn)之外的任何地方，從而產(chǎn)生無(wú)細(xì)胞區(qū)。細(xì)胞播種后，凝膠點(diǎn)被去除，允許遷移細(xì)胞穿過(guò)該區(qū)域并關(guān)閉間隙。細(xì)胞單層中的這種“人造傷口”可用于研究細(xì)胞遷移、細(xì)胞增殖和傷口閉合。由于間隙在板孔內(nèi)有明確區(qū)域和位置，使得這種方法比傳統(tǒng)的劃痕檢測(cè)顯示更一致。
本文使用 Radius 96 孔細(xì)胞遷移分析試劑盒描述了 Spark多功能酶標(biāo)儀的成像功能監(jiān)測(cè)細(xì)胞遷移的應(yīng)用。
此外，本文說(shuō)明了細(xì)胞匯合度和細(xì)胞內(nèi) ATP 含量之間的相關(guān)性，作為細(xì)胞活力和新陳代謝的指標(biāo)。
材料和方法
遷移
Radius 96 孔細(xì)胞遷移分析試劑盒（Cell Biolabs，CBA-126）與 Spark 多功能酶標(biāo)儀的匯合成像功能結(jié)合，監(jiān)測(cè)兩種膽道癌細(xì)胞系（“CL1”和“CL2”） 30 小時(shí)內(nèi)細(xì)胞遷移和增殖。CL1 具有可忽略的遷移特性，而 CL2 具有高遷移活性。將細(xì)胞在補(bǔ)充有L-谷氨酰胺(L-glutamine)、青霉素(penicillin)/鏈霉素(streptomycin)、丙酮酸鈉(sodiumpyruvate) 和 HEPES + 10% 胎牛血清 (FCS) 的 DMEM 高葡萄糖中培養(yǎng)。對(duì)于遷移實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到不含 FCS 的培養(yǎng)基中以最大限度地減少細(xì)胞分裂，并且能夠監(jiān)測(cè)遷移活動(dòng)。然后將細(xì)胞以 3x104 個(gè)細(xì)胞/孔的初始密度（預(yù)先確定最佳接種密度）接種到透明的 Radius 96 孔細(xì)胞遷移分析微孔板（隨試劑盒提供）中，并培養(yǎng)過(guò)夜。在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)移除Radius 板的插入物，并在 30 小時(shí)內(nèi)監(jiān)測(cè)遷移細(xì)胞對(duì)無(wú)細(xì)胞區(qū)域的再增殖情況。
在Spark上檢測(cè)遷移以兩種方式進(jìn)行：手動(dòng)和自動(dòng)/動(dòng)力學(xué)設(shè)置。
1.手動(dòng)：實(shí)驗(yàn)期間將96板保存在傳統(tǒng)的 CO2 培養(yǎng)箱中，并在 0、2、4、6、8、24 和 30 小時(shí)時(shí)轉(zhuǎn)移到儀器中進(jìn)行讀數(shù)。
2.自動(dòng)化：整個(gè)測(cè)量在 Spark 酶標(biāo)儀內(nèi)進(jìn)行，在整個(gè)測(cè)量期間能夠保持 5% CO2 和 37 °C，使用儀器的環(huán)境控制功能創(chuàng)建自動(dòng)化工作流程。
在手動(dòng)設(shè)置中，每次測(cè)量均在終點(diǎn)模式而不是動(dòng)力學(xué)模式下進(jìn)行。對(duì)于自動(dòng)化/動(dòng)力學(xué)設(shè)置，在 30 小時(shí)的整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間記錄匯合度，每 30 分鐘有一個(gè)測(cè)量點(diǎn)。表 1 總結(jié)了自動(dòng)/動(dòng)力學(xué)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)的測(cè)量設(shè)置。匯合模式設(shè)置為“中央”，這意味著從每個(gè)板孔的中心拍攝并分析了一張中央圖片。重要的是，“中央”模式僅在感興趣區(qū)域（即無(wú)細(xì)胞點(diǎn)）位于孔的中間時(shí)才有用。測(cè)量/成像區(qū)域不能在孔內(nèi)重新定位，檢測(cè)到的匯合值僅反映分析點(diǎn)中細(xì)胞覆蓋區(qū)域的百分比。然后根據(jù)圖片計(jì)算的匯合值作為細(xì)胞遷移的反比指標(biāo)進(jìn)行評(píng)估，假設(shè)初始 (0h) 值代表 100% 無(wú)細(xì)胞區(qū)域。
匯合與細(xì)胞 ATP 含量的相關(guān)性
使用 CellTiter-Glo® 發(fā)光細(xì)胞活力試劑盒(Promega,G7571) 檢測(cè)和量化細(xì)胞中的 ATP 水平。該方法是一種基于ATP 水平定量確定培養(yǎng)物中活細(xì)胞數(shù)量的均質(zhì)方法，作為樣品中存在代謝活性活細(xì)胞的指標(biāo) [2]。
同樣，使用兩種膽道癌細(xì)胞系（“CL3”和“CL4”）并以每孔初始細(xì)胞數(shù)范圍（25000、12500、6750、3125）接種到 96 孔板中和 1563 個(gè)細(xì)胞/孔）。 24、30、48 和 50 小時(shí)后，使用“全孔”模式測(cè)量每個(gè)孔中的匯合度，然后立即在相同孔中進(jìn)行 ATP 定量測(cè)定。通過(guò)計(jì)算發(fā)光/匯合比來(lái)評(píng)估結(jié)果，并根據(jù) Grubbs 異常值檢測(cè)測(cè)試識(shí)別和去除異常值。
結(jié)果
遷移模式
使用 Spark 酶標(biāo)儀的匯合功能可以清楚地看到兩種不同細(xì)胞系的預(yù)期遷移模式（圖1）。雖然 CL1 沒有或只有微不足道的遷移，但 CL2 在分析期間表現(xiàn)出無(wú)細(xì)胞區(qū)域的連續(xù)遷移和再增殖。
雖然在整個(gè)分析期間的遷移行為顯示了手動(dòng)和自動(dòng)處理的相似動(dòng)態(tài)，但后者的優(yōu)點(diǎn)是不會(huì)由于操作人員的非工作時(shí)間而丟失數(shù)據(jù)點(diǎn)。因此，自動(dòng)化處理提供了對(duì)細(xì)胞遷移動(dòng)態(tài)一致且無(wú)間隙的分析。
在圖 2 中可以清楚地看到無(wú)細(xì)胞區(qū)域的持續(xù)重新填充，并記錄了填充的過(guò)程。在 30 小時(shí)分析期間，可以觀察到超過(guò)一半的初始無(wú)細(xì)胞區(qū)域的再增殖，無(wú)細(xì)胞區(qū)域隨著細(xì)胞遷移到圓圈中的增加而逐漸變小。在圖 1 和圖 2 中，假設(shè)初始值 (0 h) 代表 100% 無(wú)細(xì)胞區(qū)域。所有其他值均與初始情況相比較（另見表 2）。
通過(guò) Spark Control™ 軟件在選定測(cè)量區(qū)域檢測(cè)到的逆匯合值來(lái)確定遷移程度，即孔中心的單張圖片（圖2）。為了準(zhǔn)確確定間隙區(qū)域，推薦使用 ImageJ等第三方圖像分析軟件。
匯合度與細(xì)胞 ATP 含量的相關(guān)性
圖3 顯示了在細(xì)胞接種時(shí)使用不同的接種細(xì)胞數(shù)在 54小時(shí)內(nèi)的匯合度和ATP生物發(fā)光之間的相關(guān)性。隨著時(shí)間的推移，兩種信號(hào)都表現(xiàn)出相似的動(dòng)態(tài)，表明細(xì)胞的逐漸生長(zhǎng)，其特征在于細(xì)胞 ATP 含量的增加和孔底細(xì)胞密度的增加。接種細(xì)胞數(shù)低于 3000 個(gè)細(xì)胞/孔時(shí)，匯合度超出推薦范圍（<10%），因此建議使用更高的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行可靠的實(shí)驗(yàn)。當(dāng)接種細(xì)胞數(shù)量高于3125 個(gè)/孔，可以觀察到 ATP 信號(hào)和匯合度之間的良好相關(guān)性，表明可以使用匯合測(cè)量來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化接種細(xì)胞數(shù)，而不需要額外通過(guò)檢測(cè) ATP 含量來(lái)確定細(xì)胞數(shù)。
結(jié)論
這項(xiàng)研究的結(jié)果表明，Spark 酶標(biāo)儀平臺(tái)非常適合檢測(cè)細(xì)胞遷移和匯合度測(cè)定，例如 Radius 96 孔細(xì)胞遷移測(cè)定。該儀器基于明場(chǎng)成像的匯合功能，能夠?qū)?xì)胞運(yùn)動(dòng)進(jìn)行高質(zhì)量和無(wú)標(biāo)記的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，從而量化和跟蹤細(xì)胞遷移的動(dòng)態(tài)。酶標(biāo)儀的 SparkControl 軟件可以輕松量化微孔板孔中的細(xì)胞匯合度，用戶可進(jìn)行模式選擇，用于分析孔內(nèi)的不同區(qū)域并自動(dòng)檢測(cè)任何類型微孔板的孔邊界。
該平臺(tái)擁有將匯合度與細(xì)胞 ATP 含量相關(guān)聯(lián)的能力，通過(guò)無(wú)人值守的自動(dòng)化實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步簡(jiǎn)化了基于細(xì)胞的分析工作流程。由于匯合度檢測(cè)是非標(biāo)記定量技術(shù)，并且不會(huì)干擾任何其他細(xì)胞特性或性質(zhì)，因此，它可以在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間連續(xù)進(jìn)行，為更傳統(tǒng)、昂貴且費(fèi)時(shí)費(fèi)力的技術(shù)提供了一種簡(jiǎn)單可靠的替代方法，非常適用于確定目標(biāo)細(xì)胞群體的大小或質(zhì)量。
參考文獻(xiàn)
[1] Radius 96-Well Cell Migration Assay, Product Manual,CBA-126, Cell Biolabs Inc., San Diego, USA
[2]CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay,Technical Bulletin 288, 03/15, Promega, Madison,WI, USA
（文章來(lái)源：hmez.huimeihealth.com.cn/hm/scrm/scrmmobile/eda/1654764549508362240）
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