| 什么是蛋白質(zhì)磷酸化？
蛋白質(zhì)磷酸化是在蛋白質(zhì)激酶催化下，把ATP的磷酸基轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)氨基酸殘基(絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸)上，使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，產(chǎn)生活性進(jìn)而行使功能的過(guò)程。而磷酸化的蛋白在蛋白磷酸酶的作用下又可以去磷酸
化，整個(gè)過(guò)程是可逆的。
蛋白質(zhì)磷酸化有什么用？
蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化是可逆性調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能的重要方式，幾乎涉及所有生理、病理過(guò)程，如細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、基因表達(dá)與調(diào)控、神經(jīng)遞質(zhì)的合成與釋放，甚至細(xì)胞癌變等。通過(guò)蛋白質(zhì)的磷酸化與去磷酸化，細(xì)胞控制著信號(hào)的傳遞過(guò)程，進(jìn)而影響細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)與功能，在生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。
蛋白質(zhì)磷酸化如何檢測(cè)？
在進(jìn)行蛋白質(zhì)磷酸化Western Blot分析檢測(cè)時(shí)，需要同時(shí)檢測(cè)磷酸化蛋白水平和該蛋白的總水平，但兩者分子量差距很小，使用化學(xué)發(fā)光方法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，需要先使用磷酸化蛋白抗體進(jìn)行孵育、檢測(cè)，之后進(jìn)行剝離，再重新孵育該蛋白的抗體進(jìn)行檢測(cè)。
既然化學(xué)發(fā)光Western Blot檢測(cè)法檢測(cè)磷酸化蛋白這么麻煩，那有沒(méi)有什么方法可以實(shí)現(xiàn)磷酸化蛋白快速便捷的檢測(cè)呢？
作者Xiomaris M. Cotto-Rios等利用LI-COR Odyssey 進(jìn)行Western Blot，檢測(cè)了目的蛋白（抗原/抗體）是否表達(dá)、表達(dá)的特異性、表達(dá)量的高低。文中作者使用不同熒光基團(tuán)標(biāo)記的二抗，同時(shí)檢測(cè)了磷酸化蛋白水平和該蛋白的總水平，無(wú)需進(jìn)行剝離及再孵育，大大縮短了磷酸化蛋白檢測(cè)的時(shí)間，實(shí)現(xiàn)了高效便捷的磷酸化蛋白水平和該蛋白的總水平檢測(cè)。由于藥物篩選實(shí)驗(yàn)的高通量性，本文還用到了LI-COR In cell western（無(wú)需裂解細(xì)胞、制膠、上樣、跑膠、轉(zhuǎn)膜等步驟，直接在96孔/384孔板進(jìn)行點(diǎn)Western Blot），進(jìn)行高通量的Western Blot蛋白定性定量分析。
In-cell western 技術(shù)優(yōu)勢(shì)
1、省時(shí)，直接在微孔板檢測(cè)，無(wú)需細(xì)胞裂解、跑膠和轉(zhuǎn)膜等過(guò)程；
2、高通量，一次可實(shí)現(xiàn)6*96/384個(gè)樣品檢測(cè)；
3、數(shù)據(jù)變異小，直接對(duì)細(xì)胞內(nèi)的蛋白進(jìn)行檢測(cè)，特異性好，靈敏度高；
4、雙通道同時(shí)檢測(cè)，不同熒光標(biāo)記二抗同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)蛋白
In-cell western 技術(shù)優(yōu)勢(shì)
1、省時(shí)，直接在微孔板檢測(cè)，無(wú)需細(xì)胞裂解、跑膠和轉(zhuǎn)膜等過(guò)程；
2、高通量，一次可實(shí)現(xiàn)6*96/384個(gè)樣品檢測(cè)；
3、數(shù)據(jù)變異小，直接對(duì)細(xì)胞內(nèi)的蛋白進(jìn)行檢測(cè)，特異性好，靈敏度高；
4、雙通道同時(shí)檢測(cè)，不同熒光標(biāo)記二抗同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)蛋白
文章研究背景
BRAF激酶是眾所周知的ERK信號(hào)通路的關(guān)鍵效應(yīng)因子，在許多癌癥中被過(guò)度激活。然而在許多腫瘤中，BRAF二聚體也會(huì)介導(dǎo)ERK信號(hào)傳導(dǎo)。因此有些FDA批準(zhǔn)的RAF抑制劑對(duì)BRAF二聚體的抑制效果不佳，從而也會(huì)導(dǎo)致腫瘤的耐藥性。Ponatinib（普納替尼）是FDA批準(zhǔn)的藥物，是BRAF單體和二聚體的有效抑制劑，Ponatinib可結(jié)合BRAF二聚體，并通過(guò)與先前未發(fā)現(xiàn)的變構(gòu)位點(diǎn)相互作用來(lái)穩(wěn)定一個(gè)獨(dú)特的αC-螺旋構(gòu)象?；谏鲜鲆言诮Y(jié)構(gòu)方面取得的研究成果，接下來(lái)要介紹的這篇文章，作者研究開(kāi)發(fā)了一種新的BRAF抑制劑—PHI1，與Ponatinib都將更有助于對(duì)BRAF依賴性腫瘤的治療。
部分?jǐn)?shù)據(jù)展示
RAF二聚體激酶抑制劑的篩選
首先為了實(shí)現(xiàn)對(duì)RAF二聚體激酶抑制劑的鑒定，作者使用SKMEL239-C4黑素瘤細(xì)胞建立了基于In cell western篩選的測(cè)定方法（見(jiàn)下圖a、b）。在 Vemurafenib（維莫非尼，BRAF選擇性抑制劑）誘導(dǎo)的抑制BRAF的選擇壓力下，允許表達(dá)p61BRAF（p61BRAF對(duì)Vemurafenib病毒有抗藥性，可在患者的腫瘤中發(fā)現(xiàn)）的細(xì)胞優(yōu)先生長(zhǎng)，即這類細(xì)胞可產(chǎn)生BRAF的剪接突變體，其以不依賴于RAS的方式通過(guò)二聚體形式進(jìn)行信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)。對(duì)未經(jīng)藥物處理或用增加濃度的 Vemurafenib處理過(guò)3小時(shí)的SKMEL239-C4細(xì)胞，測(cè)定其細(xì)胞內(nèi)的蛋白磷酸化水平。微孔板的In cell western圖像顯示的是細(xì)胞中磷酸化ERK1(綠色)和總ERK1(紅色)的熒光抗體孵育后的表達(dá)情況及其合并圖像(圖2c)。基于磷酸化ERK (p-ERK)和總ERK熒光讀數(shù)的 In cell western ，檢測(cè)到的信號(hào)動(dòng)態(tài)范圍廣泛，并且在低濃度的 Vemurafenib下重現(xiàn)了SKMEL239-C4細(xì)胞的p-ERK 抗性。相反，Trametinib，一種FDA批準(zhǔn)的MEK抑制劑，在低nM濃度下有效地抑制ERK信號(hào)傳導(dǎo)(圖2e)。作者使用具有非抑制濃度的Vemurafenib作為陰性對(duì)照和0.1μM Trametinib陽(yáng)性對(duì)照的96孔格式，獲得0.68的Z因子(圖2f)。作者發(fā)現(xiàn) ，Ponatinib是一種有效的BRAF抑制劑，具有與其他RAF抑制劑相似的效力。
Ponatinib能有效抑制致癌性BRAF
接下來(lái)，檢測(cè)Ponatinib依賴于BRAFV600E，p61BRAFV600E和 RASMUT/BRAFWT的ERK信號(hào)傳導(dǎo)抑制腫瘤細(xì)胞的能力。為了與BRAFV600E單體的有效抑制劑進(jìn)行比較，作者使用了Vemurafenib。Ponatinib在0.3-0.5μM的劑量下抑制BRAFV600E和p61BRAFV600E依賴性黑素瘤細(xì)胞中的ERK信號(hào)傳導(dǎo)。然而，需1-3μM的劑量才能有效抑制RASMUT/BRAFWT黑素瘤或肺癌細(xì)胞中的信號(hào)傳導(dǎo)，這表明由于RAF引發(fā)的一些抗性與其他αC-IN 抑制劑類似(圖3a)。
Ponatinib抑制ERK信號(hào)傳導(dǎo)而不降低SKBR3細(xì)胞中的RASWT-GST水平，而Lapatinib抑制ERK信號(hào)傳導(dǎo)并如預(yù)期的那樣顯著降低RASWT-GST水平(圖3b)。
用設(shè)計(jì)的抑制劑開(kāi)發(fā)BRAF變構(gòu)部位
基于對(duì)Ponatib-BRAFV600E 二聚體結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)已鑒定的BP-IVallosteric位點(diǎn)。通過(guò)KinomeEDGE篩選和SelectScreen等研究結(jié)果表明，BRAF構(gòu)象的特異性結(jié)構(gòu)變化以及PHI1與αCallosteric位點(diǎn)的相互作用導(dǎo)致PHI1對(duì)BRAF對(duì)其他激酶的特異性增加。
最后，評(píng)估PHI1對(duì)肺腺癌H2087和H1666細(xì)胞以及由RASMUT/BRAFWT驅(qū)動(dòng)的SKMEL-2和SKMEL-30黑素瘤細(xì)胞系的抑制作用。在非康奈非尼處理的細(xì)胞中，檢測(cè)到PHI1的低p-ERK抑制(圖5a，b)。相比之下，在康奈非尼預(yù)處理后，PHI1在H2087和H166肺癌細(xì)胞系中均表現(xiàn)出亞微摩爾p-ERK抑制，在H2087中具有更顯著的作用(圖4a，b)。綜上所述，這些結(jié)果表明PHI1對(duì)BRAF二聚體的第二位點(diǎn)具有獨(dú)特的特異性，并且在不同類型的BRAF抑制劑之間具有明顯的正協(xié)同抑制機(jī)制。
LI-COR Biosciences公司在近紅外熒光成像領(lǐng)域已有25年的積淀。
25年來(lái)，LI-COR Odyssey®雙色紅外激光成像系統(tǒng)由于可實(shí)現(xiàn)Western Blot精確定量，多重Western Blot檢測(cè)，且重復(fù)性更高，通量更高，擁豐富的應(yīng)用范圍，因而得到了全球生物醫(yī)學(xué)研究人員的信賴。
豐富的多功能應(yīng)用
(文章來(lái)源：www.ebiotrade.com)
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