在新一代測(cè)序（NGS）中，許多文庫(kù)制備方法都需要用到PCR擴(kuò)增。盡管許多PCR酶能高效、準(zhǔn)確且特異地?cái)U(kuò)增單個(gè)靶點(diǎn)，但很少有酶是專為NGS設(shè)計(jì)的，能夠無(wú)偏倚地?cái)U(kuò)增不同大小和GC含量的靶點(diǎn)。
為此，Wellcome Sanger研究所的研究人員近日對(duì)20多種高保真PCR酶進(jìn)行測(cè)評(píng)，以選擇最適合短讀長(zhǎng)測(cè)序和長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序應(yīng)用的PCR聚合酶和產(chǎn)品。這項(xiàng)成果發(fā)表在《Microbial Genomics》雜志上。
在測(cè)試的20多種酶中，他們發(fā)現(xiàn)Quantabio公司的RepliQa HiFi ToughMix、Watchmaker公司的Equinox Amplification Master Mix以及Takara公司的Ex Premier DNA聚合酶是擴(kuò)增短讀長(zhǎng)文庫(kù)的“首選酶”。同時(shí)，Quantabio公司的RepliQa HiFi ToughMix也在長(zhǎng)讀長(zhǎng)文庫(kù)擴(kuò)增競(jìng)賽中脫穎而出。
Wellcome Sanger研究所負(fù)責(zé)測(cè)序研發(fā)的首席科學(xué)家Michael Quail領(lǐng)導(dǎo)了這項(xiàng)工作。他的研究團(tuán)隊(duì)曾在十年前評(píng)測(cè)了在短讀長(zhǎng)Illumina文庫(kù)擴(kuò)增中表現(xiàn)最佳的酶。他們當(dāng)時(shí)選出了Roche公司的Kapa HiFi DNA聚合酶，并將結(jié)果發(fā)表在《Nature Methods》雜志上。
Quail表示：“在過(guò)去的十年中，各家公司都開(kāi)發(fā)出了新的PCR酶。我們想用一些新產(chǎn)品來(lái)重復(fù)這項(xiàng)研究。”
在這項(xiàng)新研究中，研究人員比較了20多種市售的高保真PCR酶產(chǎn)品，它們來(lái)自眾多的NGS樣本制備試劑供應(yīng)商，包括Roche、Takara、Thermo Fisher Scientific、Agilent Technologies、New England Biolabs、Bio-Rad Laboratories和QIAGEN等。
為了對(duì)短讀長(zhǎng)擴(kuò)增的各種酶進(jìn)行基準(zhǔn)測(cè)試，研究人員以四種GC含量不同的微生物基因組作為PCR模板來(lái)制備Illumina測(cè)序文庫(kù)，它們分別是：百日咳桿菌、大腸桿菌、艱難梭菌和惡性瘧原蟲(chóng)。
對(duì)于測(cè)試的每種酶，他們使用制造商建議的變性和延伸時(shí)間，以1 ng文庫(kù)片段為模板進(jìn)行14個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增。他們發(fā)現(xiàn)Quantabio RepliQa、Kapa HiFi、Invitrogen Platinum SuperFi II、Watchmaker Equinox和Takara Ex Premier等酶的產(chǎn)量較高。
同時(shí)，Quantabio RepliQa、Watchmaker Equinox和Takara Ex Premier對(duì)所有的基因組都表現(xiàn)出很好的覆蓋均一性。此外，這三種酶擴(kuò)增后檢測(cè)SNP和插入缺失時(shí)的靈敏度最高。
在長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序的文庫(kù)制備過(guò)程中，長(zhǎng)距離PCR通常更有挑戰(zhàn)性，因?yàn)楫a(chǎn)量較低，而且擴(kuò)增過(guò)程偏向于較小的片段。為了測(cè)試PCR酶在這種應(yīng)用中的適用性，研究人員制備了21.6 kb和13.3 kb的酵母DNA片段，并在添加Illumina接頭后作為模板。
他們發(fā)現(xiàn)，Quantabio RepliQa和Takara Terra聚合酶帶來(lái)了最長(zhǎng)的插入片段，約為12 kb。不過(guò)作為Taq的衍生物，Terra的錯(cuò)誤率較高。在將測(cè)序文庫(kù)用于PacBio測(cè)序時(shí)，RepliQa和Terra聚合酶也給出了最連續(xù)的組裝結(jié)果。
研究人員認(rèn)為，不同PCR酶在擴(kuò)增片段的產(chǎn)量和均一性方面存在明顯差異。他們認(rèn)為Quantabio RepliQa、Watchmaker Equinox和Takara Ex Premier可擴(kuò)增極端的GC含量，其覆蓋偏倚與PCR-free數(shù)據(jù)相似。
“令人驚訝的是，不同酶之間的產(chǎn)量差異很大，這再次說(shuō)明用戶應(yīng)當(dāng)精心挑選PCR酶，因?yàn)槭褂玫托У拿缚赡軙?huì)導(dǎo)致產(chǎn)量偏低，因此用戶需要采用更多的PCR循環(huán)，從而使偏倚更嚴(yán)重，”作者寫道。
(文章來(lái)源：www.ebiotrade.com/newsf/2024-6/2024619142634191.htm) | 
