長期以來，檢測和分析蛋白質的能力一直是科學家們的關鍵追求。幾十年來，對蛋白質檢測準確性和可靠性的追求促進了一系列技術飛躍。從早期的凝膠電泳和 Western blotting 的發(fā)明到自動化 Western 分析的發(fā)展，研究人員不斷突破蛋白質分析工具的界限。
1807年，科學家首次觀察到在電場作用下，水中的粘土顆粒向正極移動的現(xiàn)象，這一現(xiàn)象為電泳奠定了基礎。直到20世紀50年代，隨著淀粉和聚丙烯酰胺等電泳基質的引入，研究人員才開始使用凝膠電泳技術從復雜的混合物中分離蛋白質1。然而，這些早期的電泳方法無法區(qū)分大小相似的蛋白質。1970年，在醫(yī)學研究委員會分子生物學實驗室研究噬菌體T4的分子生物學家烏爾里希·萊姆利（Ulrich Laemmli）意識到，一種名為十二烷基硫酸鈉（SDS）的蛋白質變性洗滌劑可以幫助根據分子量將多肽鏈分離出來，因為它們在凝膠中遷移時會發(fā)生這種變化。通過創(chuàng)建一種含有不同濃度SDS和聚丙烯酰胺的不連續(xù)雙層凝膠系統(tǒng)，萊姆利能夠更清楚地觀察到蛋白質條帶。這種方法現(xiàn)在被稱為SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），它使他能夠識別出構成噬菌體T4衣殼的先前未知的蛋白質2。與此同時，其他研究人員正在使用凝膠電泳來分離 DNA 等生物分子。1975 年，愛丁堡大學的分子生物學家埃德溫·索恩（Edwin Southern）通過從電泳分離的片段中檢測特定 DNA 序列，將這項技術向前推進了一步。為了實現(xiàn)這一目標，他引入了一個新步驟：印跡。在瓊脂糖凝膠上分離 DNA 片段后，他將它們轉移到硝酸纖維素膜上，從而捕獲 DNA3。然后，他使用可以與特定 DNA 序列結合的放射性 RNA 探針，并通過放射自顯影法檢測它們。索恩以自己的名字將這項發(fā)明命名為 Southern blotting。
隨著Southern blotting成為分析DNA樣本的流行工具，它也激發(fā)了研究人員探索其在其他應用中的潛力。1977年，斯坦福大學的生化學家喬治·斯塔克（George Stark）和他的同事們通過使用一種名為重氮芐氧甲基（DBM）紙的化學改性纖維素作為轉移RNA分子的介質，引入了一種RNA印跡法4。他們將這種創(chuàng)新命名為“Northern blotting”，以反映其與Southern blot的聯(lián)系。在成功之后，斯塔克的團隊進一步將印跡法應用于蛋白質分析，并于1979年7月發(fā)表了他們的方法。他們對萊姆利的不連續(xù)凝膠系統(tǒng)進行了修改，通過將聚丙烯酰胺/瓊脂糖凝膠混合物加入細胞裂解液中來分離蛋白質。用于蛋白質轉移時，他們使用了DBM紙，并使用放射性蛋白質來探測靶蛋白。使用該方法，該小組成功地鑒定了感染猴痘病毒的腫瘤抗原5。
與此同時，世界另一端的兩位生物化學家，弗里德里希·米歇爾研究所的哈里·托賓 （Harry Towbin） 和弗雷德·哈奇癌癥中心的尼爾·伯內特 （Neal Burnette） 正在獨立開發(fā)一種類似的蛋白質印跡方法。兩個團隊都建立了一種電泳印跡程序來轉移蛋白質，其中包括使用電場將蛋白質從電泳凝膠驅動到硝酸纖維素膜上。哈里·托賓利用一抗結合靶蛋白，然后使用放射性或熒光標記的二抗檢測一抗。尼爾·伯內特的蛋白質檢測方法略有不同——他使用了一抗和二抗放射性標記蛋白。哈里·托賓在1979年發(fā)表了他的方法，比斯塔克的論文發(fā)表晚了兩個月，而伯內特的手稿是在同一時期準備的，但最初被拒絕。1981年，伯內特的論文被同一本雜志接受，他將這種方法稱為 Western blotting6.
蛋白質印跡很快引起了全世界研究人員的注意。在它誕生后的頭十年里，它成為了檢測與疾病相關的蛋白質的關鍵診斷工具。一些研究人員將WB應用于血液樣本中HIV抗體的識別7，而另一些人則用它來檢測由錯誤折疊的朊蛋白引起的克雅氏病8。在此期間，技術進步使 Western 印跡更容易獲得。研究人員引入了新的膜材料，例如聚偏二氟乙烯和尼龍，以改進印跡過程。這些材料耐用、穩(wěn)定，可以更有效地結合蛋白質。檢測方法也發(fā)生了變化。化學發(fā)光法（使用與酶聯(lián)次級抗體反應后發(fā)出光的化學發(fā)光底物）取代放射性方法，成為更受歡迎的用于觀察蛋白質條帶的方法。
盡管有這些改進，但對于進行 Western blotting實驗的研究人員來說，該技術也有一定的局限性。Western blot方法的實驗步驟較多，操作較為復雜且耗時較長，并且該技術對實驗條件要求較高，如電泳分離不充分、轉印不完全、封閉不足或抗體特異性差等都會影響最終的結果。此外，該技術無法完成對蛋白質的絕對定量，對于低豐度蛋白也很難很難檢測到清晰準確的條帶。且傳統(tǒng) Western blot的低通量性難以滿足大規(guī)模篩選、組學研究等對多樣本、多蛋白同時分析的需求。
為了解決傳統(tǒng) Western blot的局限性，2011 年，ProteinSimple 團隊在人類蛋白質組組織年度世界大會上推出了第一臺基于毛細管的自動化 Simple Western 儀器 Simon™ 系統(tǒng)。相對于傳統(tǒng)的蛋白質印跡來說，Simon™顯著提高了蛋白質分析的準確性和可重復性。2014 年，ProteinSimple （于2014年被Bio-Techne收購）推出了 Wes™ 系統(tǒng)，它可在 3 小時內處理多達 25 個樣品，靈敏度是 Simon™的 10 倍。
為了滿足客戶的需求，Bio-Techne在2018年推出了 Jess™ 系統(tǒng)，它具有化學發(fā)光和熒光雙重檢測功能，使用戶能夠檢測樣品中的更多靶標。并且 Jess™ 系統(tǒng)還集成了內置的總蛋白測量功能，以便更輕松地進行數據標準化。此外，Bio-Techne還開發(fā)了一種創(chuàng)新的 RePlex™ 檢測試劑盒，該檢測試劑盒模擬了傳統(tǒng)蛋白質印跡中的剝離和重新檢測步驟，但在同一毛細管內，使研究人員能夠從每個樣品中提取更多數據。Simon™、Wes™ 和 Jess™ 的成功只會推動 Bio-Techne進行更多創(chuàng)新。
此后，Bio-Techne一直致力于擴展 Simple Western 的能力，以更好地支持不同的研究需求。例如，2021年推出的 Abby™ 系統(tǒng)為尋求自動化 Western 印跡工作流程的研究人員提供了一種易于訪問、經濟實惠的解決方案。
2024年，Bio-Techne隆重推出 Simple Western 家族的最新成員：Leo™系統(tǒng)。Leo™ 一次運行可處理多達 100 個樣品，并僅需 3 小時即可提供結果，顯著提高了通量，使其成為藥物篩選和生物標志物發(fā)現(xiàn)等大規(guī)模研究的理想選擇。其擴展的多重檢測功能允許每個樣品檢測多達 8 個蛋白質靶標，為研究人員提供來自單個實驗的更全面的數據。這些功能使 Leo™ 成為支持各種研究領域和藥物開發(fā)階段的多功能工具。
參考文獻1. Sule, R., Rivera, G. & Gomes, A. V. Western Blotting (immunoblotting): History, Theory, Uses, Protocol and Problems. BioTechniques 75, 99–114 (2023).
2. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature 227, 680–685 (1970).
3. Southern, E. M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 98, 503–517 (1975).
4. Alwine, J. C., Kemp, D. J. & Stark, G. R. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes. Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 5350–5354 (1977).
5. Renart, J., Reiser, J. & Stark, G. R. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure. Proc. Natl. Acad. Sci. 76, 3116–3120 (1979).
6. Burnette, W. N. “Western Blotting”: Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal. Biochem. 112, 195–203 (1981).
7. Esteban, JuanI. et al. IMPORTANCE OF WESTERN BLOT ANALYSIS IN PREDICTING INFECTIVITY OF ANTI-HTLV-III/LAV POSITIVE BLOOD. The Lancet 326, 1083–1086 (1985).
8. Brown, P. et al. Diagnosis of Creutzfeldt-Jakob Disease by Western Blot Identification of Marker Protein in Human Brain Tissue. N. Engl. J. Med. 314, 547–551 (1986).
